邢作志，張 雁

(1 甘州區(qū)畜牧獸醫(yī)工作站，甘肅 張掖 734000；2 張掖市農業(yè)綜合行政執(zhí)法隊，甘肅 張掖 734000)

小反芻獸疫(Peste des Petits Ruminants，PPR)是由小反芻獸疫病毒(Peste des Petits Ruminants Virus，PPRV)引起山羊和綿羊的一種急性接觸性傳染病，世界動物衛(wèi)生組織將其列為必須報告的動物疫病，我國將其列為一類動物疫病。本病以發(fā)病率高和死亡率高為特點，嚴重威脅著畜牧業(yè)的發(fā)展。本次試驗主要應用競爭ELISA、間接ELISA和阻斷ELISA三種免疫抗體檢測方法檢測小反芻獸疫病毒的免疫抗體，以此評價小反芻獸疫疫苗的免疫效果。

1 試驗材料

1.1 檢測樣品

血清樣品采集自甘州區(qū)轄區(qū)內經小反芻獸疫活疫苗免疫的羊，要求清亮且無溶血。

1.2 試驗器材

RT-6100酶標儀、37 ℃恒溫箱、500 mL量筒、純水儀、5 μL～50 μL單道移液器、10 μL～100 μL多道移液器、50 μL～300 μL多道移液器、配套移液槍頭、加液槽和96孔抗原抗體反應板均為試驗常用儀器，小反芻獸疫競爭ELISA抗體檢測試劑盒、間接ELISA抗體檢測試劑盒和阻斷ELISA抗體檢測試劑盒分別購自中國農業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所、深圳真瑞生物科技有限公司和青島立見診斷技術發(fā)展中心。

2 試驗方法

2.1 競爭ELISA抗體檢測

2.1.1 加樣

依次加入以下試劑及樣品：① 待檢血清，每份血清必須做兩個重復孔，每孔加入待檢血清樣品50 μL；②對照，每塊酶標板上均應設標準陰性血清、陽性血清、單克隆抗體及空白對照孔，其中標準陰性血清應設2孔，標準陽性血清應設2孔，每孔加入相應血清50 μL，空白對照設2孔，每孔加入100 μL血清稀釋液，單克隆抗體對照設4孔，每孔加入50 μL血清稀釋液；③加單抗，將單克隆抗體用血清稀釋液進行1∶100倍稀釋，除空白對照孔外其他各孔每孔加50 μL稀釋后的單克隆抗體。

小反芻獸疫競爭ELISA抗體檢測樣品布板情況見圖1。

2.1.2 孵育

完成加樣后，將酶標板置于微量振蕩器上振蕩混勻，隨后置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育1 h。

2.1.3 洗酶標板加酶結合物

取出酶標板甩干，用洗滌液(1×PBST)洗滌3次，在吸水紙上拍干，用血清稀釋液按1∶100稀釋兔抗鼠IgG-HRP結合物，每孔加入50 μL，然后置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育1 h。

2.1.4 洗酶標板加底物溶液

取出酶標板甩干，用洗滌液(1×PBST)洗滌3次，在吸水紙上拍干，每孔加入底物溶液50 μL，置37 ℃避光靜置顯色反應 10 min～ 15 min。

2.1.5 加終止液并讀數

顯色反應結束后，每孔加入終止液50 μL，終止反應，在酶標儀上讀取OD450nm值。

2.1.6 結果判定

根據公式：PI＝[1-(樣品孔的OD450nm值/單抗對照孔OD450nm值)]×100%進行判定。

判定標準：① 當陰性對照孔PI＜40%，陽性對照孔PI＞60%時檢測結果成立，否則該次檢測結果無效；②樣品血清PI≥45%，抗體陽性，PI＜40%，抗體陰性，40%≤PI＜45%，則判定為可疑。

2.2 間接ELISA抗體檢測

小反芻獸疫間接ELISA抗體檢測樣品布板情況見圖2。

⑴ 血清稀釋：在血清稀釋板中按1∶100的體積比稀釋待檢血清，每個樣品在加入包被板前應充分混勻。

⑵ 將稀釋好的待檢血清加入包被好的酶標板中，每孔100 μL，同時設陰性對照1孔和陽性對照2孔，每孔加入相應的血清100 μL，蓋上封板膜，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育30 min。

⑶ 取出酶標板甩干，用工作濃度洗滌液洗滌4～6次，在吸水紙上拍干，每孔加入50 μL酶結合物，然后置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育30 min。

⑷ 取出酶標板甩干，用工作濃度洗滌液洗滌4～6次，在吸水紙上拍干，每孔加入100 μL顯色液，置37 ℃避光靜置顯色反應10 min。

⑸ 顯色反應結束后，每孔加入50 μL終止液，終止反應，在酶標儀上讀取OD450nm值。

⑹ 結果判定：陰性對照的OD450nm值＜0.2，陽性對照的OD450nm值＞0.4時試驗成立；樣品OD450nm值/陽性對照的OD450nm均值＝S/P值，S/P值 ≥ 0.3判為陽性，S/P值＜0.3判為陰性。

2.3 阻斷ELISA抗體檢測

小反芻獸疫阻斷ELISA抗體檢測樣品布板情況見圖3。

⑴ 在陰性對照孔和陽性對照孔中加入相應的血清，每孔50 μL，在酶標單抗對照孔中加入50 μL稀釋液。在每個樣品孔中加入25 μL稀釋液，再加入25 μL待檢血清，然后置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育1 h。

⑵ 取出酶標板甩干，用洗滌液(用超純水做20倍稀釋，按5‰比例加入吐溫-20)(1×)洗滌4次，在吸水紙上拍干，用血清稀釋液按5倍稀釋酶標單抗，每孔加入50 μL，然后置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育30 min。

⑶ 取出酶標板甩干，用洗滌液(1×)洗滌4次，在吸水紙上拍干，每孔加入底物溶液50 μL，室溫避光靜置顯色反應10 min～ 15 min。

⑷ 顯色反應結束后，每孔加入50 μL終止液，終止反應。在酶標儀上讀取OD450nm值，計算阻斷率。阻斷率(PB)計算方法：PB＝100-[待檢血清OD450nm值(或對照OD450nm平均值)]×100%/Cm的 OD450nm平均值。

⑸ 對結果進行判定。陽性對照的阻斷率(PB)＞60，陰性對照的阻斷率(PB)＜40，試驗結果有效；待檢樣品阻斷率(PB)＞50判為陽性，待檢樣品阻斷率(PB)≤50判為陰性。

3 結果與討論

⑴ 競爭ELISA、間接ELISA和阻斷ELISA三種免疫抗體檢測方法都可對小反芻獸疫病毒免疫抗體進行檢測，在同一塊96孔酶標板中，競爭ELISA、間接ELISA和阻斷ELISA可以分別檢測43份、93份和90份樣品，但是競爭ELISA和間接ELISA的操作相對比較復雜，且用時較多；阻斷ELISA的操作簡單，用時少。如果同時檢測100份樣品，競爭ELISA、間接ELISA和阻斷ELISA的準確率分別為85%、88%和95%，因此阻斷ELISA的準確度和重復性均高于其他兩種檢測方法，是小反芻獸疫病毒免疫抗體檢測的首選檢測方法。

⑵ 小反芻獸疫對反芻動物的危害大，發(fā)病率和病死率通常分別超過60%和50%，該病最有效的防控手段是給動物接種小反芻獸疫疫苗，因此，小反芻獸疫病毒免疫抗體是評價羊場安全及經濟效益的最理想的指標，選擇正確的抗體檢測方法也是重中之重。