谷澤慧 ，任立群，李琪，王亞帝，譚琦，婁小倩，陳素賢

0 引言

胃癌是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，據(jù)2019年發(fā)布的全球癌癥統(tǒng)計(jì)報(bào)告結(jié)果顯示，全球胃癌發(fā)病例數(shù)約103.4萬，死亡例數(shù)為75.3萬，分別居全球第五位和第三位，居我國第三位和第二位[1-2]。胃癌的早期診治與預(yù)后密切相關(guān)，同時(shí)其轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及耐藥性與療效及預(yù)后密切相關(guān)[3]。傳統(tǒng)的治療手段效果并不顯著，5年生存率僅為40%，而伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者5年生存率低于5%[4]，進(jìn)展期胃癌患者的中位生存時(shí)間僅11月左右[5]。近年來，以肺癌、乳腺癌和結(jié)腸癌[6-8]為代表的實(shí)體腫瘤中，分子靶向治療取得了較好療效。不同miRNA的靶基因表達(dá)量也不同[9]。說明胃癌的發(fā)生與miRNA、靶基因密切相關(guān)，本研究旨在挖掘伴隨胃癌發(fā)生相關(guān)的miRNA與靶基因，從新的角度識(shí)別核心基因和miRNA。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人胃癌SGC-7901細(xì)胞株（由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)院實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)，本實(shí)驗(yàn)室凍存儲(chǔ)備）、NCBI、Targetscan、StarBase和miRBase數(shù)據(jù)庫。

1.2 主要試劑

miR-7-5p mimics、miR-7-5p mimics NC、miR-7-5p inhibitor、miR-7-5p inhibitor NC和轉(zhuǎn)染試劑購自蘇州吉瑪基因股份有限公司；注射用奧沙利鉑（OXA）購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司；兔抗人Bax、Bcl-2、caspase-3、caspase-9一抗購自中國武漢愛博泰克生物科技有限公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；胎牛血清購自浙江天杭生物科技股份有限公司；噻唑藍(lán)染液（MTT）、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒和二甲基亞砜（DMSO）購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司；熒光定量PCR試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；Hoechst33258染色液購自中國碧云天生物技術(shù)有限公司；流式細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒購自美國BD公司。

1.3 主要儀器

超凈工作臺(tái)購自美國Thermo Forma公司；Strata Gene Mx3000P熒光實(shí)時(shí)定量分析系統(tǒng)購自美國Agilent Technologies公司；mini-protean小垂直板電泳系統(tǒng)購自美國Bio-Rad Laboratories Inc公司；Molecular Devices; E-CLIPSE 80i顯微鏡購自日本Nikon Instruments Inc公司；CO2恒溫培養(yǎng)箱購自美國SIM公司。

1.4 細(xì)胞體外培養(yǎng)

SGC-7901細(xì)胞于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，兩天換液一次，0.25%胰蛋白酶消化，每周傳代3次，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.5 生物信息學(xué)方法

通過NCBI-pubmed數(shù)據(jù)庫檢索出MAPK家族與胃癌細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因和miRNA，生物信息學(xué)軟件TargetScan、StarBase和miRBase數(shù)據(jù)庫進(jìn)行互靶驗(yàn)證并取交集，找到互靶關(guān)系良好的miRNA與靶基因，通過DAVID分析中GO分析與KEGG通路富集，找到評(píng)分較高保守性良好的作為研究對(duì)象。

1.6 Real-time PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染是否成功及時(shí)間節(jié)點(diǎn)

待細(xì)胞單層占孔底的70%～80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，8 h更換有血清培養(yǎng)液培養(yǎng)，24 h后收樣，提取各組SGC-7901細(xì)胞miRNA，配置反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，配成20 μl的穩(wěn)定體系，37℃水浴鍋孵育60 min，85℃加熱5 s失活RT Enzyme Mix。采用Real-time PCR試劑盒，配置20 μl的Real-time PCR反應(yīng)體系，檢測(cè)Ct值，利用2-ΔΔCt公式計(jì)算miR-7-5p的相對(duì)表達(dá)量，引物序列見表1。分別計(jì)算24、36、48 h miR-7-5p的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.7 實(shí)驗(yàn)及藥物處理分組

奧沙利鉑（OXA），4℃保存，實(shí)驗(yàn)時(shí)現(xiàn)用現(xiàn)配，用無血清培養(yǎng)液稀釋。實(shí)驗(yàn)分為六組：空白對(duì)照組（藥物濃度為0 μmol/L）、過表達(dá)組（miR-7-5p mimics）、過表達(dá)陰性對(duì)照組（miR-7-5p mimics NC）、沉默組（miR-7-5p inhibitor）、沉默陰性對(duì)照組（miR-7-5p inhibitor NC）和OXA組（藥物濃度33 μmol/L）。

1.8 實(shí)驗(yàn)方法

1.8.1 Real-time PCR驗(yàn)證miR-7-5p與RAF1靶向關(guān)系 一塊6孔板分別加入1 ml無血清培養(yǎng)液和1 ml RAF1抑制劑（6 nmol/L濃度處理），另一塊6孔板中三孔分別加miR-7-5p mimics、miR-7-5p mimics NC為5 μl和無血清培養(yǎng)液，提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄生成cDNA，Real-time PCR實(shí)驗(yàn)分析，測(cè)出相應(yīng)的Ct值。利用2-ΔΔCt公式計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量，GAPDH作為內(nèi)參。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.8.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 每孔200 μl接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每組設(shè)7個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)44 h，吸去培養(yǎng)液，每孔加入MTT溶液（5 mg/ml）200 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，小心吸去MTT溶液，按照每孔150 μl加入DMSO，搖床上搖晃15 min，使結(jié)晶充分溶解，于酶標(biāo)儀上檢測(cè)490 nm波長檢測(cè)相應(yīng)的OD值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.8.3 Hoechst33258核染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡形態(tài) 收樣后使用Hoechst33258染色液染色，抗熒光淬滅封片液封片后，于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)變化情況，Images Advanced3.2成像系統(tǒng)采集圖像，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

表1 Real-time PCR檢測(cè)基因的引物序列Table 1 Primer sequences detected by Real-time PCR

1.8.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 收樣，1000 r/min離心5 min，棄培養(yǎng)液，1 ml PBS洗滌后，加入預(yù)冷的70%乙醇溶液，4℃固定至少18 h，離心棄固定液，PBS清洗一次，棄PBS，加入0.5 ml PI染液，37℃避光孵育30 min后重懸細(xì)胞，1 h內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8.5 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 細(xì)胞單層融合度接近100%孔底時(shí)，用200 μl的黃槍頭垂直在細(xì)胞上劃線，PBS洗去漂浮的細(xì)胞，轉(zhuǎn)染加藥，放置于37℃的CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，顯微鏡下觀察細(xì)胞劃痕愈合情況，拍照保存，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.8.6 Western blot檢測(cè)相關(guān)分子蛋白表達(dá)水平 收樣后，經(jīng)消化、洗滌、裂解、煮沸、離心，收集蛋白，上樣，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，5%的脫脂奶粉封閉1 h，一抗（1:2 000）4℃孵育過夜，TBST洗膜后加入對(duì)應(yīng)的二抗（1:5 000），超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測(cè)雜交信號(hào)，Image Quant LAS 4000 Mini凝膠成像儀自動(dòng)曝光，分析灰度值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS22.0處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布并經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以（±s）表示，不同組間miR-7-5p的表達(dá)差異比較使用t檢驗(yàn)，兩兩之間比較采用LSD檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生物信息學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

通過NCBI-pubmed進(jìn)行文獻(xiàn)檢索，共篩選出27個(gè)miRNA和66個(gè)基因存在于MAPK家族當(dāng)中并與人類胃癌緊密相關(guān)，且具有顯著的作用。

2.1.1 胃癌相關(guān)miRNA靶基因的預(yù)測(cè) 利用生物信息學(xué)軟件TargetScan、StarBase和miRBase數(shù)據(jù)庫進(jìn)行靶向關(guān)系驗(yàn)證并取交集，有四對(duì)互靶關(guān)系評(píng)分較高且保守性良好，見表2。

表2 基因與miRNA的相互靶標(biāo)關(guān)系Table 2 Targeting relation between gene and miRNA

2.1.2 胃癌相關(guān)miRNA靶基因的功能 發(fā)現(xiàn)有且僅有miR-7-5p—RAF1這一對(duì)存在于MAPK家族之中，RAF1可能通過其674-681位堿基與miR-7-5p的3’UTR高度互補(bǔ)結(jié)合，見圖1。

2.2 Real-time PCR檢驗(yàn)轉(zhuǎn)染是否成功、轉(zhuǎn)染時(shí)間節(jié)點(diǎn)及miR-7-5p與RAF1靶向關(guān)系

圖1 KEGG通路富集分析結(jié)果前二十名Figure 1 Top 20 of pathway enrichment by KEGG

miR-7-5p在胃癌SGC-7901細(xì)胞中的表達(dá)顯著降低（P=0.001），見圖2A。miR-7-5p mimics與Control和miR-7-5p mimics NC組相比顯著升高（P=0.029），證明轉(zhuǎn)染成功，見圖2B。轉(zhuǎn)染24、36和48 h，miR-7-5p在胃癌SGC-7901細(xì)胞中的表達(dá)逐漸升高，故將48 h作為轉(zhuǎn)染的時(shí)間結(jié)點(diǎn)，見圖2C。RAF1在胃癌SGC-7901細(xì)胞中的表達(dá)上調(diào)（見Control組），對(duì)miR-7-5p過表達(dá)后RAF1呈下降趨勢(shì)（P=0.002），見圖3A，且使用RAF1抑制劑后，miR-7-5p的相對(duì)表達(dá)量明顯升高（P=0.048），見圖3B。說明miR-7-5p與RAF1存在互靶關(guān)系。

2.3 OXA、miR-7-5p過表達(dá)及沉默對(duì)各組細(xì)胞的生長抑制情況

miR-7-5p過表達(dá)（miR-7-5p mimics）、沉默（miR-7-5p inhibitor）及給藥處理48 h后，與對(duì)照組相比，miR-7-5p mimics和OXA組抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞的生長，且miR-7-5p mimics組抑制作用更顯著（P=0.004，P=0.002），miR-7-5p inhibitor促進(jìn)胃癌SGC-7901細(xì)胞的生長（P=0.045），見表3。

2.4 細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)觀察

圖2 Real-time PCR法檢測(cè)胃癌SGC-790細(xì)胞中miR-7-5p的表達(dá)(A)、驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果(B)及轉(zhuǎn)染時(shí)的節(jié)點(diǎn)(C)Figure 2 miR-7-5p expression(A) in SGC-7901,transfection efficiency(B) and transfection time node(C) detected by Real-time PCR

圖3 Real-time PCR法檢測(cè)胃癌SGC-790細(xì)胞中miR-7-5p和RAF1的表達(dá)(A)及互靶關(guān)系(B)Figure 3 miR-7-5p,RAF1 expression(A) and their correlation(B) detected by Real-time PCR

轉(zhuǎn)染及給藥處理48 h后，經(jīng)過Hoechst33258染色，熒光顯微鏡下顯示，正常細(xì)胞的細(xì)胞核呈彌散均勻藍(lán)色熒光，而凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核濃染致密，或呈顆粒碎塊狀，顏色發(fā)白發(fā)亮。miR-7-5p mimics和OXA組均可見到此種凋亡細(xì)胞的表現(xiàn)，見圖4。

表3 OXA和miR-7-5p mimics組抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞的生長 (±s,n=7)Table 3 OXA and miR-7-5p mimics group inhibited the growth of gastric cancer SGC-7901 cells (±s,n=7)

表3 OXA和miR-7-5p mimics組抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞的生長 (±s,n=7)Table 3 OXA and miR-7-5p mimics group inhibited the growth of gastric cancer SGC-7901 cells (±s,n=7)

2.5 miR-7-5p及OXA對(duì)胃癌細(xì)胞周期的影響

轉(zhuǎn)染及給藥處理48 h后，與對(duì)照組相比，miR-7-5p mimics組與OXA組周期進(jìn)程減慢，G0/G1期百分率增加，G2/M期百分率降低，說明miR-7-5p mimics與OXA均具有減慢細(xì)胞周期從而抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖的作用，而miR-7-5p inhibitor作用相反（P=0.002,P=0.000），見圖5。

2.6 細(xì)胞劃痕愈合情況

轉(zhuǎn)染及給藥處理48 h后，與Control組相比，miR-7-5p inhibitor組侵襲轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)（P=0.001），而miR-7-5p mimics與OXA組細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力降低（P=0.022），見圖6。

2.7 相關(guān)分子蛋白含量檢測(cè)結(jié)果

圖4 SGC-7901細(xì)胞33258核染色形態(tài)觀察 (×200)Figure 4 33258 nuclear staining morphology of SGC-7901 cells (×200)

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同組SGC-7901細(xì)胞的細(xì)胞周期 (±s,n=3)Figure 5 SGC-7901 cell cycle detected in different groups by flow cytometry (±s,n=3)

圖6 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SGC-7901細(xì)胞的愈合形態(tài)Figure 6 Morphology of SGC-7901 cells detected by scratch healing assay

Western blot實(shí)驗(yàn)灰度值分析表明：與Control組相比，miR-7-5p mimics及OXA可顯著上調(diào)caspase-3、caspase-9、Bax及下調(diào)Bcl-2、p-RAF1的蛋白表達(dá)水平（均P<0.05）,且呈劑量相關(guān)性，見圖7。

圖7 Western blot檢測(cè)SGC-7901細(xì)胞中Bcl-2、Bax、Cleaved-caspase-3、Cleaved-caspase-9、RAF1和p-RAF1的表達(dá)Figure 7 Bcl-2,Bax,Cleaved-caspase-3,Cleavedcaspase-9,RAF1 and p-RAF1 expression in SGC-7901 cells detected by Western blot

3 討論

microRNA（miRNA）是一種在真核生物中普遍存在的具有調(diào)控功能的內(nèi)源性小分子RNA。自1993年首次在秀麗隱桿線蟲體內(nèi)發(fā)現(xiàn)miRNA編碼基因-lin-4基因之后[10]，相繼在果蠅、植物以及人的多種組織中發(fā)現(xiàn)了它的存在[11]。正常細(xì)胞中，miRNA通過與靶基因mRNA特異性結(jié)合，促使靶基因mRNA的降解或者翻譯抑制，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化以及凋亡等多種生理學(xué)過程。而在腫瘤細(xì)胞中，某些miRNA可以影響正常的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，通過調(diào)控下游基因的表達(dá)來調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化以及凋亡等生理學(xué)過程，進(jìn)而在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起到類似促癌基因或抑癌基因的作用[12]。miR-7位于第15號(hào)染色體上，是一種高度保守的小分子RNA，miR-7與癌癥的發(fā)生發(fā)展有著非常緊密的關(guān)系，在多種腫瘤細(xì)胞中呈異常表達(dá)，如神經(jīng)腫瘤、宮頸癌、膀胱癌和肝癌等[13-16]。作為miR-7的重要分支，miR-7-5p發(fā)揮著非常重要的作用。

奧沙利鉑作為臨床上常用的抗腫瘤藥物，在療效方面發(fā)揮著重要的作用，雖主要作用于患者腫瘤病灶，但長期使用會(huì)造成血液毒性、腎毒性、耳毒性及全身損害等嚴(yán)重不良反應(yīng)[17-18]，尋找可以替代的低毒藥物或者分子層面的治療成為了一個(gè)新思路。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)組與奧沙利鉑組均會(huì)促進(jìn)胃癌SGC-7901細(xì)胞的凋亡，減慢細(xì)胞周期進(jìn)程，將大量細(xì)胞維持在G0/G1期。Cleavedcaspase3和Cleaved-caspase9蛋白表達(dá)量顯著升高，當(dāng)caspase家族被激活后，在caspase前體的N-端前肽和大亞基之間的特定位點(diǎn)被水解去除N-端前肽，然后在大小亞基之間切割釋放大小亞基，進(jìn)而形成兩兩組成的有活性的異四聚體。此時(shí)caspase3對(duì)執(zhí)行者caspase9進(jìn)行切割并使之激活，caspase9通過對(duì)caspase靶蛋白的水解，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡。說明miR-7-5p mimics與OXA均可促進(jìn)胃癌細(xì)胞的凋亡，且miR-7-5p mimics與OXA組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在抑制胃癌細(xì)胞的增殖方面無明顯差異。本實(shí)驗(yàn)通過前期生物信息學(xué)理論基礎(chǔ)與Real-time PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，miR-7-5p與RAF1存在互靶關(guān)系，且有證據(jù)表明，熒光素酶活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)鑒定RAF1是miR-7-5p的直接靶點(diǎn)[19]。Western blot結(jié)果也顯示miR-7-5p與RAF1含量呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)。

綜上所述，miR-7-5p可以通過過表達(dá)或沉默靶基因RAF1，與化療藥物奧沙利鉑同樣起到抑制胃癌細(xì)胞的作用，提示奧沙利鉑可能通過上調(diào)miRNA-7-5p促進(jìn)胃癌細(xì)胞SGC-7901的凋亡、減慢侵襲轉(zhuǎn)移速度。低毒高效的miR-7-5p在未來分子層面的治療有可能取代奧沙利鉑。