張麗軒，劉朝奇，李志英

0 引言

眾所周知，宮頸癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌等惡性腫瘤疾病嚴重威脅著女性健康，然而到目前為止，人類未曾完全明確女性惡性腫瘤的發(fā)生機制。早發(fā)現(xiàn)早診斷早治療可有效減少惡性腫瘤患病率，提高生存率。Wnt信號通路中β-連環(huán)蛋白（β-catenin）異常表達與女性惡性腫瘤具有相關(guān)性[1]，分泌型卷曲相關(guān)蛋白（secreted frizzled-related proteins,SFRPs）作為Wnt信號通路抑制劑，與細胞膜上的受體卷曲蛋白（frizzled,Frz）競爭性抑制Wnt蛋白，間接影響β-catenin水平和Wnt信號通路的下游癌基因，從而調(diào)控女性惡性腫瘤的發(fā)生。因此，隨著SFRPs的深入研究，SFRPs可作為一種生物分子診斷疾病，同時為女性惡性腫瘤的治療提供潛在價值線索。

1 Wnt信號通路與SFRPs蛋白家族的關(guān)系

根據(jù)Wnt配體的不同，普遍認為Wnt信號通路包括經(jīng)典和非經(jīng)典Wnt信號通路。經(jīng)典Wnt信號通路即Wnt/β-catenin通路，非經(jīng)典Wnt信號通路主要包括Wnt/PCP通路（planar cell polarity pathway）和Wnt/Ca2+途徑。

在經(jīng)典Wnt/β-catenin通路中，Wnt蛋白主要與細胞膜上的受體卷曲蛋白（frizzled,Frz）、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白（low density lipoprotein receptor-related protein 5/low density lipoprotein receptor-related protein 6,LRP5/LRP6）結(jié)合，并誘導散亂蛋白（Dishevelled,Dsh/Dvl）磷酸化，導致β-catenin復(fù)合體降解，β-catenin復(fù)合體主要由腺瘤性結(jié)腸息肉病蛋白基因（adenomatous polyposis coli,APC）、糖原合成激酶3（glycogen synthase kinase-3β,GSK3β）、酪蛋白激酶1（casein kinase 1,CK1）等構(gòu)成，核內(nèi)和胞質(zhì)中的β-catenin水平發(fā)生改變，進入細胞核的β-catenin與雙向調(diào)節(jié)因子T細胞因子/淋巴樣增強因子（T cell factor/lymphoid enhancer factor,TCF/LEF）相互作用調(diào)節(jié)靶基因，啟動增強Wnt/β-catenin通路下游原癌基因表達，最終導致腫瘤的發(fā)生[2]，見圖1。

圖1 SFRPs對經(jīng)典Wnt信號通路的調(diào)控Figure 1 SFRPs control in the classical Wnt signaling pathway

在非經(jīng)典Wnt/PCP通路中，Wnt蛋白通過激活Dsh下游區(qū)Ras同源基因家族成員A（Ras homolog gene family member A,RhoA）、受體相關(guān)共激酶（receptor-associated cokinase,Rac）、細胞周期分裂蛋白42（cell division cycle protein 42,Cdc42）等，進而影響細胞骨架結(jié)構(gòu)。在非經(jīng)典Wnt/Ca2+途徑中，Wnt蛋白與定位于細胞膜上的Frz受體結(jié)合，調(diào)節(jié)胞內(nèi)鈣離子量,可激活蛋白激酶C（protein kinase C,PKC）、鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶CaMKⅡ、活化T細胞核因子（nuclear factor of activated T cells,NFAT）以及其他信號轉(zhuǎn)導因子和轉(zhuǎn)錄因子，影響細胞增殖與遷移[2]。

Wnt蛋白參與啟動Wnt信號通路，是Wnt信號通路的關(guān)鍵生物因子，在發(fā)育過程中正確塑造組織生長及維持穩(wěn)定性。1982年，Wnt1作為原癌基因首次被發(fā)現(xiàn)，是目前研究者發(fā)現(xiàn)的19個Wnt蛋白中的第1個成員，編碼370個氨基酸的蛋白質(zhì)，是Wnt通路的始動蛋白，能激活經(jīng)典信號轉(zhuǎn)導通路[3]。由于SFRPs的N末端富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域CRD，其與Frz結(jié)構(gòu)相似，能競爭性結(jié)合Frz受體蛋白，拮抗Wnt信號通路，從而抑制了腫瘤細胞的增殖活力，是Wnt信號通路的負調(diào)控因子。除上述主要調(diào)控機制以外，有研究者曾提出，SFRPs對Wnt信號通路的調(diào)控機制可能還存在以下幾種途徑：（1）在SFRPs中，結(jié)構(gòu)域CRD與CRD之間，通過滴定活性的方式影響Wnt蛋白與細胞膜上Frz受體的結(jié)合。（2） SFRPs與細胞膜上的Frz受體形成非功能性復(fù)合物，以正-負反饋方式發(fā)揮作用。（3）SFRPs與Wnt蛋白直接結(jié)合形成一種功能性復(fù)合體，對細胞膜上的Frz受體產(chǎn)生正性信號，從而激活通路[4]。另外，SFRPs啟動子甲基化或超甲基化狀態(tài)能夠?qū)е耂FRPs基因失活，其蛋白質(zhì)合成減少，無法有效阻斷Wnt信號通路，通路下游癌基因表達增強，導致細胞異常增殖和腫瘤的發(fā)生。SFRPs啟動子甲基化是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下，以S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體，將甲基基團轉(zhuǎn)移到胞嘧啶和鳥嘌呤二核苷酸的胞嘧啶中5位碳原子上，并與其3′端的鳥嘌呤形成mCpG。SFRPs啟動子甲基化可在轉(zhuǎn)錄水平抑制基因表達?？傊?，SFRPs蛋白家族與Wnt蛋白的關(guān)系十分復(fù)雜，因此，深入研究二者之間表達的相關(guān)性具有十分重要的意義，并有望作為臨床檢測指標，輔助疾病診斷與治療。

2 SFRPs的組成與表達特點

哺乳動物表達5 種SFRPs，統(tǒng)一命名為SFRP1-5。SFRPs定位于染色體8p12～11.1，SFRPs的相對分子質(zhì)量為40 000，每個蛋白具有兩個獨立的結(jié)構(gòu)域，N末端為富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域CRD（cysteine-rich domain,CDR），由10個半胱氨酸組成5對二硫橋。C末端為一個紡錘蛋白樣的尼特林結(jié)構(gòu)域（the netrin module,NTR）[5]。

SFRPs作為Wnt信號通路抑制劑，其生物表達特點具有多樣性：（1）SFRPs調(diào)控細胞分化。一項研究發(fā)現(xiàn)，在白色脂肪細胞分化為成熟脂肪細胞過程中，SFRP4 mRNA和蛋白表達水平升高，并在第14天達到高峰，提示白色脂肪細胞已達到終末分化狀態(tài)。其中，脂質(zhì)體增殖物激活受體γ（proliferators activate receptor γ,pPARγ）、葡萄糖轉(zhuǎn)運體4（glucose transport-4,GLUT4）顯著降低[6]。我們推測SFRP4可能作為脂肪發(fā)生的啟動子，促進了白色脂肪細胞分化，是脂肪形成過程中不可或缺的一部分。（2）SFRPs影響細胞極化。一項研究發(fā)現(xiàn)，細胞極化與PCP核心蛋白Vangl1、Vangl2、Prickle2和Celsr1的表達密切有關(guān)[7]。存在SFRP1、SFRP2和SFRP5的情況下，細胞膜上均能檢測到PCP核心蛋白。但是，當缺乏SFRP1、SFRP2和SFRP5時，PCP核心蛋白未能在細胞上表現(xiàn)出極化定位。據(jù)此推測SFRPs參與了細胞極化，它的表達與否對影響細胞極化是顯而易見的。（3）SFRPs參與早期發(fā)育。在一項敲除小鼠基因的研究中發(fā)現(xiàn)，發(fā)育早期的正常肺組織中，SFRP1與Wnt5a、Wnt10b密切相關(guān)，阻斷SFRP1表達會導致肺泡異常擴張[8]。在胚胎發(fā)育過程中，SFRPs發(fā)揮著重要作用，SFRPs異常表達會破壞蛋白酶依賴的肺泡重塑過程，影響肺實質(zhì)和肺泡大小。（4）SFRPs可作為血清標志物及抗腫瘤因子。研究發(fā)現(xiàn)，用人血清抗體檢測SFRP4，提示SFRP4可作為慢性乙型肝炎、肝細胞癌的血清標志物，對診斷肝疾病具有重要意義，為了提高肝細胞癌的診斷準確率，可以聯(lián)合檢測SFRP4和AFP[9]。數(shù)據(jù)顯示，在肝細胞癌組與慢性肝炎組、非肝細胞癌組中，肝細胞癌組SFRP4表達量明顯高于另外兩組。甲胎蛋白和甲胎蛋白受體工作特征曲線顯示，在慢性肝炎組和肝癌組中，SFRP4敏感度降低，特異性上升，AFP敏感度和特異性呈略升趨勢，SFRP4和AFP聯(lián)合檢測的敏感度和特異性分別可提升至79.2%和 95.3%，ROC曲線下面積（AUC）可升高到0.941（95%CI:0.908～0.975）。另外，SFRPs是一組可溶性蛋白，故具有細胞基質(zhì)蛋白的特征：（1）由不同類型細胞分泌；（2）與細胞外基質(zhì)有關(guān)；（3）組織重塑發(fā)生率高；（4）擴增生長[10]。

3 SFRPs對女性惡性腫瘤的作用

SFRPs異常表達與女性惡性腫瘤的發(fā)生存在一定的聯(lián)系，見表1。

表1 SFRPs在女性惡性腫瘤中的表達Table 1 Expression of SFRPs in female malignant tumors

3.1 SFRPs與宮頸癌

Ghoshal等[11-12]利用谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶GST（glutathione S-transferase,GST）標記SFRP1（GSTSFRP1），并克隆到pGEX-4T2原核表達載體中，結(jié)果證實，GST-SFRP1抗宮頸癌HeLa細胞和乳腺癌MCF-7細胞增殖活力呈劑量依賴性，同時聯(lián)合化療藥物能有效提高抗癌活性。使用適宜劑量的純化重組的SFRP4對宮頸癌和肺癌進行治療，對細胞生長抑制作用高達40%，尤其在G2/M期阻滯和早期凋亡較為明顯。SFRP4通過下調(diào)Wnt通路下游原癌基因Cyclin D1、C-myc和Survivin，抑制細胞增殖。故SFRP1、SFRP4上調(diào)能明顯抑制宮頸癌細胞增殖。蘭健等[13]研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌病灶SFRP2 mRNA和蛋白表達明顯低于癌旁病灶；當SFRP2高表達時，Wnt信號通路下游靶基因C-myc和Cyclin D1的mRNA和蛋白表達水平均減少。提示SFRP2參與調(diào)控了宮頸癌生物學行為。鄭朝坂等[14]發(fā)現(xiàn)宮頸癌病灶內(nèi)SFRP2表達量與癌細胞凋亡、細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）過程具有相關(guān)性。其次，宮頸癌病灶內(nèi)凋亡基因SP2、CyclinD1、Piwil2、HERC4、EFEMP1的mRNA表達量均顯著高于癌旁病灶，差異具有統(tǒng)計學意義。提示低表達的SFRP2能夠增加凋亡基因的表達，進而抑制癌細胞凋亡。曹麗雯等[15]發(fā)現(xiàn)，SFRP1在正常宮頸、宮頸上皮內(nèi)瘤變、宮頸鱗癌細胞膜的表達逐漸缺失，而β-catenin在細胞質(zhì)、細胞核中的表達逐漸增強。不同F(xiàn)IGO分期與浸潤深度的宮頸鱗癌組織β-catenin表達差異有統(tǒng)計學意義。SFRP1蛋白表達與人乳頭狀瘤病毒（human papillomavirus,HPV）感染呈負相關(guān)。胡丹妮等[16]通過Mass-Array甲基化定量分析多個CpG位點，提示相關(guān)的甲基化位點在CpG12.13、CpG18區(qū)域。聚類分析顯示SFRP1在宮頸癌樣本中的甲基化率顯著高于上皮內(nèi)瘤變組和正常對照組，提示由癌前病變到宮頸癌的發(fā)展中SFRP1基因甲基化起了連續(xù)性的作用。另外，在HPV16陽性和陰性兩組中，SFRP1基因甲基化差異不顯著，提示HPV16感染與SFRP1基因甲基化無關(guān)。由此我們推測SFRP1參與了宮頸癌的演變過程，但HPV感染是否與SFRP1基因甲基化導致的基因沉默引起相關(guān)蛋白表達降低有關(guān)需要進一步研究。因此可將β-catenin蛋白、SFRP1和HPV三者聯(lián)合檢測增加特異度和靈敏度，并作為宮頸癌的嚴重程度預(yù)測指標及治療靶點。

3.2 SFRPs與卵巢癌

Al-Shabanah等[17]采用特異性PCR方法發(fā)現(xiàn)，在卵巢癌組織中SFRP1、2、4、5甲基化率分別為42%、63%、51%、55%。另外，在HPV16和HPV18感染中SFRP2、4、5甲基化率分別為61%、52%、57%和70%、65%、55%。提示SFRPs甲基化在調(diào)控或促進卵巢癌發(fā)生中起重要作用，SFRPs甲基化能沉默基因表達，并促進卵巢癌細胞的侵襲，或許可能成為卵巢癌的血清標志物。Kardum等[18]利用免疫組織化學和特異性PCR研究發(fā)現(xiàn)，正常卵巢組織、高分化漿液性卵巢癌及低分化漿液性卵巢癌中SFRP1蛋白表達呈下降趨勢，而基因甲基化率呈上升趨勢。因此SFRP下調(diào)可能促進卵巢癌的發(fā)生。郭玉霞等[19]研究了Wnt信號通路中的關(guān)鍵因子Wnt3a、Wnt4、Wnt11、C-myc和SFRP2，發(fā)現(xiàn)Wnt3a下游基因C-myc上調(diào)，SFRP2在卵巢癌中顯著下調(diào)。然而SFRP2與哪一個配體結(jié)合調(diào)控了癌細胞的增殖還需要進一步分析。Gu等[20]研究發(fā)現(xiàn)，活化遷移至卵巢癌組織內(nèi)的骨髓間充質(zhì)干細胞可以通過釋放miR-1180分子,識別并下調(diào)卵巢癌細胞中的SFRP1蛋白，由此提高Wnt通路活性?；罨蟮腤nt信號通路可增強癌細胞內(nèi)糖酵解水平（即Warburg效應(yīng)）,從而引起糖酵解依賴性化療耐藥行為。根據(jù)上述研究，我們猜想SFRPs與Wnt蛋白的相互作用調(diào)控了卵巢癌細胞生物學行為，影響了卵巢癌發(fā)生及臨床預(yù)后，同時兩者聯(lián)合檢測或許能提高診斷的準確率，對卵巢癌的診斷有積極意義。

3.3 SFRPs與子宮內(nèi)膜癌

Yu等[21]研究發(fā)現(xiàn)SFRP2對人胚胎干細胞向子宮內(nèi)膜樣細胞分化具有重要作用，SFRP2可降低分化效率，Wnt5a對人胚胎干細胞向子宮內(nèi)膜樣細胞分化有明顯促進作用，Wnt7a無明顯促進作用。我們推測子宮內(nèi)膜上皮細胞的形成需要Wnt蛋白和SFRPs促進子宮內(nèi)膜腺體的發(fā)育，但異常表達增高的SFRPs可能抑制子宮內(nèi)膜上皮細胞形成，進而影響子宮內(nèi)膜細胞正常生理調(diào)控，使正常子宮內(nèi)膜細胞向癌細胞轉(zhuǎn)化。另外有文獻報道，子宮內(nèi)膜癌細胞與正常細胞相比，SFRP4的表達水平發(fā)生變化，SFRP4在低分化子宮內(nèi)膜肉瘤和侵襲性較強的未分化子宮內(nèi)膜肉瘤中的表達均明顯低于正常上皮。其原因可能為SFRP4啟動子異常甲基化，而SFRP4的穩(wěn)定高表達在體外可抑制子宮內(nèi)膜癌細胞的生長[22]。韓翠香等[23]用RT-PCR、Western blot法發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜癌組織中SFRP1和SFRP4蛋白表達陽性率均較對照組低。隨著FIGO分期增加，SFRP1和SFRP4蛋白及mRNA表達陽性率逐漸降低（P<0.05）。另外有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中，SFRP1和SFRP4的陽性率低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者（P<0.05）。因此SFRPs在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展中承擔著不可或缺的作用，SFRP1和SFRP4是Wnt信號通路的調(diào)節(jié)因子，在子宮內(nèi)膜細胞增殖中起重要作用，也可能是腫瘤抑制因子，進一步研究SFRPs與子宮內(nèi)膜癌因果關(guān)系，并合理干預(yù)，有助于控制子宮內(nèi)膜癌的發(fā)展，為診斷子宮內(nèi)膜癌提供新的預(yù)防靶點。

3.4 SFRPs與乳腺癌

Bhuvanalakshmi等[24]報道天然植物雌激素薯蕷皂苷元（diosgenin,DG）在許多癌癥中有抗腫瘤特性。他們先將SFRP4基因插入到質(zhì)粒中進行過表達，再用DG處理，觀察到細胞遷移和血管形成能力減弱，同時β-catenin水平降低，下游抑癌基因GSK3β表達減少，抑制了EMT效應(yīng)。證實了SFRP4在DG中起著決定性作用，SFRP4上調(diào)參與了DG介導的細胞凋亡。另有文獻研究表示，高表達SFRPs能夠減少乳腺癌的發(fā)生，SFRPs甲基化在乳腺癌中具有重要作用，并且與預(yù)后也有顯著相關(guān)性[25]。SFRP1在正常乳腺上皮細胞中表達，但在浸潤性乳腺癌組織中經(jīng)常丟失，導致SFRP1表達缺失的原因是基因啟動子甲基化。由于基因甲基化，SFRP2、SFRP5也在乳腺癌中下調(diào)，抑制乳腺上皮細胞EMT。左然等[26]在對乳腺癌潛在預(yù)后標志物分析時發(fā)現(xiàn)，SFRP1高表達者生存率比低表達者生存率高，故SFRP1高表達對乳腺癌患者預(yù)后具有保護作用（HR=0.9,P=0.015）。若SFRP1受到has-miR-342-5p抑制時則提示不良預(yù)后，因此has-miR-342-5p可能影響SFRP1的保護作用。Ren等[27]研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移性乳腺癌中Wnt/β-catenin信號拮抗劑SFRP1也是miR-454-3p的靶點，其參與了通路信號的激活，在乳腺癌細胞中，miRNP免疫共沉淀實驗顯示miR-454-3p僅與AXIN2、DKK3和SFRP1有關(guān)。并且發(fā)現(xiàn)mir-454-3p參與了乳腺癌的早期轉(zhuǎn)移過程，促進了乳腺癌細胞的干細胞生長和早期復(fù)發(fā)。根據(jù)以上研究我們猜測SFRPs參與了乳腺癌細胞分化增殖，影響了細胞自我更新能力。因此深入研究SFRPs在乳腺癌的作用，為臨床治療乳腺癌提供依據(jù)，具有積極意義。

3.5 SFRPs與人滋養(yǎng)細胞腫瘤

Partl等[28]通過動物實驗?zāi)Ｐ?，比較正常和宮內(nèi)生長受限（intrauterine growth retardation,IUGR）胎盤中SFRP1和SFRP3表達情況。在大鼠的子宮內(nèi)膜和肌層中，SFRP1和SFRP3均有表達，蛻膜細胞細胞質(zhì)染色偶呈陽性。SFRP1和SFRP3在血管內(nèi)皮細胞中的表達明顯升高。人IUGR胎盤中SFRP1和SFRP3的表達量均高于正常妊娠胎盤（P<0.0001）。與癌旁病灶相比，人滋養(yǎng)細胞腫瘤組織中SFRP1和SFRP3的表達降低。盡管上述結(jié)果的關(guān)聯(lián)并不明顯，但我們猜想，SFRP1和SFRP3可能涉及調(diào)控了IUGR胎盤功能障礙的發(fā)病機制，繼而導致人類滋養(yǎng)細胞腫瘤的發(fā)生。目前，SFRPs與人滋養(yǎng)細胞腫瘤的相關(guān)性研究較少，具體機制需要進一步研究，SFRPs對人滋養(yǎng)細胞腫瘤的診療可能具有潛在的廣闊前景。

4 小結(jié)

在Wnt信號通路中，Wnt蛋白作為生長促進因子，導致細胞增殖，在不同的時間點影響細胞周期，它的獨特之處在于誘導細胞增殖的同時也能作為定向生長因子發(fā)揮作用，正確塑造組織生長。SFRPs是Wnt轉(zhuǎn)導通路重要抑制劑，在誘導腫瘤細胞凋亡、調(diào)控細胞生長等方面具有重要意義。女性惡性腫瘤中，SFRPs啟動子的甲基化或超甲基化導致的基因沉默是一種關(guān)鍵驅(qū)動因素，促進了病理進展以及癌癥的發(fā)生。腫瘤的發(fā)生需要一個復(fù)雜的交互網(wǎng)絡(luò)，因此SFRPs啟動子甲基化并不是導致女性惡性腫瘤病變的唯一因素，SFRPs家族、Wnt蛋白、Dkk類抑制劑乃至其他信號通路之間可能存在交叉、正負反饋作用。研究SFRPs家族對于女性惡性腫瘤的靶向治療具有重要的意義，可以為女性惡性腫瘤的治療提供潛在價值線索，同時有助于預(yù)防女性惡性腫瘤的發(fā)生與進展。