胡威，祝恒成，李浩勇，劉修恒，曾艷

0 前言

腎細(xì)胞癌（renal cell carcinoma,RCC）為泌尿系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一，致死率高，預(yù)后差[1]。腎透明細(xì)胞癌（clear cell renal cell carcinoma,ccRCC）是腎細(xì)胞癌最常見的亞型，在發(fā)生轉(zhuǎn)移的RCC中占80%～85%，對(duì)傳統(tǒng)的放療和化療均不敏感[2]。目前微創(chuàng)或開放手術(shù)切除原發(fā)腫瘤仍是治療ccRCC的最主要方法，但是腎癌患者往往早期無癥狀，或僅有發(fā)熱、乏力等全身癥狀，待出現(xiàn)血尿或腫瘤體積增大壓迫其他器官導(dǎo)致腎區(qū)疼痛才被發(fā)現(xiàn)。此時(shí)往往腫瘤體積已較大，或者已發(fā)生轉(zhuǎn)移，增加了根治性腎切除術(shù)或腎部分切除術(shù)的難度。

CD248（tumour endothelial marker 1,TEM-1），又名內(nèi)皮唾酸蛋白（Endosialin），是近年來發(fā)現(xiàn)的一個(gè)腫瘤標(biāo)志物，CD248主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞與新生血管細(xì)胞的內(nèi)皮細(xì)胞表面，是周細(xì)胞和成纖維細(xì)胞表達(dá)的一種間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物[3-5]，在多種人類惡性腫瘤中高表達(dá)，如乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、腦癌、肉瘤等，而在正常組織中缺失或低表達(dá)[6-10]。然而，到目前為止CD248與腎癌的關(guān)系尚無報(bào)道。

本研究旨在探討CD248的表達(dá)在人類ccRCC組織中的區(qū)域特征、空間分布等信息，將有助于我們進(jìn)一步了解CD248是否可以作為ccRCC治療的靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集2011年3月—2016年3月在武漢大學(xué)人民醫(yī)院泌尿外科行原發(fā)腎腫瘤切除術(shù)的115例患者，均為單側(cè)根治性腎切除，術(shù)后明確病理診斷為腎透明細(xì)胞癌，同時(shí)取17例新鮮標(biāo)本，及時(shí)用液氮凍存?zhèn)溆谩；颊叩哪[瘤組織及配對(duì)癌旁組織均取自同一標(biāo)本。臨床納入標(biāo)準(zhǔn)：患者有單側(cè)腰痛或上腹痛、無痛性肉眼血尿等臨床癥狀，或偶然體檢時(shí)發(fā)現(xiàn)并初步診斷為腎占位性病變，通過全腹部CT平掃+增強(qiáng)影像學(xué)診斷為腎原發(fā)腫瘤，并排除繼發(fā)于其他器官的轉(zhuǎn)移瘤，所有入組患者需最終病理診斷為腎透明細(xì)胞癌。本研究經(jīng)武漢大學(xué)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。所有患者均簽署知情同意書。本研究將ccRCC患者分為CD248高表達(dá)組（n=67）和低表達(dá)組（n=48）。

1.2 隨訪

術(shù)后隨訪至2018年12月，隨訪時(shí)間2～72月，隨訪頻率為每兩月一次，115例患者中共101例成功隨訪，14例失訪。

1.3 免疫組織化學(xué)檢測(cè)

制作4 μm石蠟切片，根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行免疫組織化學(xué)（IHC）分析。設(shè)陽性和陰性對(duì)照，切片經(jīng)3%過氧化氫（H2O2）孵育10 min，在暗室中，室溫25℃左右以淬滅內(nèi)源過氧化物酶活性，檢測(cè)抗原。隨后，37℃混合，加一抗（1:200，CD248抗體，美國Invitrogen公司）及原抗（1:50，美國Invitrogen公司）孵育，4℃過夜。室溫25℃左右反應(yīng)15 min，PBS洗滌，加入過氧化物酶，37℃反應(yīng)40 min，Mayer蘇木精對(duì)比染色及3′-二氨基聯(lián)苯胺底物反應(yīng)。

ccRCC組織的病理學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)：腫瘤細(xì)胞的胞質(zhì)透明或嗜酸性；組織間可見小的薄壁血管組成的網(wǎng)狀間隔；一些腫瘤細(xì)胞可能呈現(xiàn)為癌巢和腺泡樣結(jié)構(gòu)；極少數(shù)腫瘤為肉瘤樣，巨細(xì)胞偶爾可見；少數(shù)腫瘤可見壞死、鈣化、骨化或纖維黏液化等。CD248染色強(qiáng)度評(píng)分定義如下：0分為無染色（-）；1～3分為弱陽性（+），黃色或棕黃色；4～6分為中度陽性（++），棕褐色；7～10分為強(qiáng)陽性（+++），褐色或黑褐色。1～6分為低表達(dá)組，7～10分為高表達(dá)組。結(jié)果采用“雙盲”法進(jìn)行評(píng)定。

1.4 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測(cè)

ABI 7300 RT-PCR系統(tǒng)分析ccRCC及癌旁組織中CD248（NM_020404）mRNA的表達(dá)。反轉(zhuǎn)錄cDNA按照產(chǎn)品操作說明書進(jìn)行，反應(yīng)體系20 μl，包括TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ（日本TaKaRa）10 μl，上下游引物各0.5 μl（10 pmol/μl）CDNA 2 μl（5 ng/μl），蒸餾水7 μl。qRT-PCR的反應(yīng)條件為94℃ 5 min預(yù)變性，94℃45 s，60℃ 60 s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔，ABI 7300系統(tǒng)SDS軟件分析mRNA的比值。引物序列為：CD248：5′-TGCGAACACGA ATGTGTGGA-3′（上游）和5′-CAATCTGGCAC TCATCTGTGTC-（下游），β-actin（內(nèi)參）：5′-GTGGACATCCGCAAAGAC-3′（上游）和5′-AAAGGGTGTAACGCAACTA-3′（下游）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，單因素方差分析比較各組間差異，兩組間比較采用q檢驗(yàn)，SPSS20.0軟件繪制患者Kaplan-Meier生存曲線，Spearman秩相關(guān)分析，并用Log rank檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，

2 結(jié)果

2.1 ccRCC及癌旁組織中CD248的免疫評(píng)分及細(xì)胞定位

免疫組織化學(xué)結(jié)果提示在ccRCC組織中，CD248免疫反應(yīng)平均得分為3.88±0.41，具體得分：3例為-，19例為+，50例為++，43例為+++，共112例陽性，陽性率為97.4%，而癌旁組織（ANCT）的平均得分1.02±0.26，具體得分：68例為-，35例為+，9例為++，3例為+++，共47例陽性，陽性率40.9%，ccRCC組織中的CD248陽性表達(dá)免疫組織化學(xué)反應(yīng)強(qiáng)度顯著強(qiáng)于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0061），且CD248蛋白陽性信號(hào)定位于細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)，見圖1。

2.2 ccRCC及癌旁組織中CD248 mRNA的表達(dá)

CD248 mRNA在癌旁組織中的表達(dá)水平明顯低于ccRCC組織（1.32±0.29vs.3.44±0.32,P=0.0026）。

2.3 CD248表達(dá)與ccRCC患者臨床病理特征的關(guān)系

CD248表達(dá)與患者年齡、性別、腎腫瘤TNM分期（參照2017年AJCC第八版指南[2]）、腫瘤大小及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無顯著相關(guān)性（均P>0.005），見表1。

圖1 CD248在腎透明細(xì)胞癌及癌旁組織中的表達(dá)和定位Figure 1 CD248 expression and localization in ccRCC and ANCT tissues

表1 CD248表達(dá)與腎透明細(xì)胞癌患者臨床病理特征的相關(guān)性Table 1 Correlation between CD248 expression and clinicopathological features of ccRCC patients

2.4 CD248蛋白水平與ccRCC患者預(yù)后的關(guān)系

Kaplan-Meier法生存分析結(jié)果顯示，CD248低表達(dá)組中位生存時(shí)間為57.2月，高表達(dá)組為44.4月，CD248高表達(dá)組OS顯著低于CD248低表達(dá)組（χ2=5.712,P=0.017），見圖2。

圖2 CD248蛋白表達(dá)水平與腎透明細(xì)胞癌患者預(yù)后的關(guān)系Figure 2 Correlation between CD248 expression and prognosis of ccRCC patients analyzed

3 討論

CD248是近年來發(fā)現(xiàn)的一個(gè)腫瘤標(biāo)志物，其基因定位于人類11號(hào)染色體llql3上，由一種單鏈跨膜糖蛋白編碼，大小為165 kDa。被定義為一種C型凝集素樣膜受體，其胞外結(jié)構(gòu)由一個(gè)信號(hào)序列、一個(gè)C型凝集素樣結(jié)構(gòu)域、一個(gè)壽司狀結(jié)構(gòu)域、三個(gè)表皮生長因子樣結(jié)構(gòu)域和一個(gè)糖基化黏蛋白結(jié)構(gòu)域組成，胞內(nèi)結(jié)構(gòu)為跨膜結(jié)構(gòu)域與細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域[3-5]。

近年來，國外學(xué)者對(duì)CD248在腎臟相關(guān)疾病中的作用進(jìn)行了系列研究，Smith等[11]發(fā)現(xiàn)CD248主要表達(dá)于腎周細(xì)胞和腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞中，在慢性腎病的腎纖維化過程中發(fā)揮重要作用。在人慢性腎?。–KD）標(biāo)本及小鼠慢性腎纖維化模型中CD248表達(dá)明顯升高，下調(diào)CD248表達(dá)能調(diào)節(jié)腎周細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的功能，從而抑制腎毛細(xì)血管稀疏化和腎間質(zhì)的纖維化[11-13]。

人類CD248的具體功能目前尚不清楚，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中基因敲除CD248可導(dǎo)致血管、腦部及直結(jié)腸腫瘤的生長抑制、侵襲性減弱、血管生成減少等[6-10]，因此CD248極有可能通過抗腫瘤血管生成而發(fā)揮抗癌作用，并成為潛在的有效治療靶點(diǎn)，同時(shí)也可能適用于腫瘤的早期診斷[14-17]。到目前為止CD248與腎腫瘤的關(guān)系尚無文獻(xiàn)報(bào)道。

本研究首次報(bào)告了ccRCC及癌旁組織中CD248的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，ccRCC組織中CD248免疫組織化學(xué)免疫強(qiáng)度及陽性率均明顯高于癌旁組織，ccRCC組織中CD248 mRNA的表達(dá)亦高于癌旁組織。本研究明確了CD248表達(dá)與ccRCC的臨床病理參數(shù)的關(guān)系，及其對(duì)ccRCC預(yù)后的評(píng)估價(jià)值，由此推測(cè)，CD248可能與ccRCC的發(fā)生、發(fā)展有著密切關(guān)系。同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)CD248的表達(dá)與患者性別、年齡、腫瘤TNM分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移并無相關(guān)性，但是，Kaplan-Meier生存分析顯示，高表達(dá)CD248組的ccRCC患者總生存率明顯低于低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這些結(jié)果表明CD248的表達(dá)與ccRCC的發(fā)生、發(fā)展呈正相關(guān)性。但是由于本研究臨床樣本量有限，CD248在此過程中的具體機(jī)制及有哪些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與其中等將在后續(xù)作進(jìn)一步研究。