于兵，尹剛，胡以平

0 引言

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是世界上最常見的惡性腫瘤之一，其致死率占惡性腫瘤的第五位。我國是HCC高發(fā)地區(qū)，臨床上HCC患者病情進展迅速、生存期短，是我國癌癥致死的第三大原因[1-2]。目前HCC發(fā)生、發(fā)展的分子機制尚不明確，但研究表明Notch、Hedgehog和Wnt等信號通路在HCC的起始、浸潤與轉移等過程中起著重要作用[3]。其中Notch信號通路是進化過程中高度保守的一條信號通路，通過相鄰細胞間受體與配體的相互作用轉導信號，參與調控細胞的增殖、分化與凋亡等過程[4]。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)Notch信號通路在不同腫瘤中有著不同的生物學作用。多項研究表明在HCC中Notch信號通路的活化可抑制HCC細胞的增殖并促進其凋亡[5-7]，因此，Notch信號通路可能是治療HCC的潛在靶點之一。

Notch信號通路由Notch受體、Notch配體、DNA結合蛋白、效應分子和調節(jié)分子等組成[8]。轉錄因子Hes1（hairy and enhancer of split homolog-1）是Notch信號通路下游主要的效應因子之一，其屬于堿性螺旋-環(huán)-螺旋（the basic helix-loophelix）家族的轉錄調節(jié)因子[9]。Hes1通過結合在目標基因啟動子區(qū)域的特定位點，如class C位點和N box結構域，從而抑制靶基因的轉錄及其自身的轉錄[10]。Hes1參與了腫瘤干細胞的自我更新、腫瘤細胞的轉移、凋亡和耐藥等過程[11]，如在HCC細胞系中降低Hes1的表達量，抑制MHCC-97L細胞的凋亡，并促進其發(fā)生肺轉移[12]。為了探討Hes1對HCC細胞系Hep1-6的作用，本實驗構建了表達Hes1基因的重組腺病毒載體并研究了Hes1對Hep1-6細胞增殖、遷移及侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑

Hep1-6和293A細胞（海軍軍醫(yī)大學細胞生物學教研室保存）置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。以0.25%胰酶、0.02%乙二胺四乙酸消化傳代。pAd-Track系統(tǒng)購自Addgene公司（美國），Match T1購自北京全式金生物技術有限公司（中國）。T4-DNA連接酶、限制性內切酶、DNA Marker、蛋白Marker、1%青霉素/鏈霉素、DMEM培養(yǎng)液、Lipofectamine 2000轉染試劑和RNA抽取試劑TRIzol購自Thermo Fisher Scientific公司（美國），PrimeSTAR HS DNA Polymerase購自TAKARA公司（中國），2×T5 Fast qPCR Mix（SYBRGreenI）購自擎科新業(yè)生物技術有限公司（中國），Transwell小室及細胞培養(yǎng)耗材購自Corning公司（美國）、質粒提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒購自生工生物公司（中國）；M-MLV反轉錄酶購自Promega公司（美國）；胎牛血清購自Hyclone公司（美國）；抗Hes1多克隆抗體購自Santa Cruz公司（美國）。

1.2 重組腺病毒載體的構建

以小鼠膽囊壁組織cDNA為模板，PCR擴增Hes1基因，上下游引物分別為5’-GCCGATATCGCCACCATGCCAGCTGATATAATGGA-3’和5’-TAACTCGAGGCTCTCAGTTCCGCCACGGTCT-3’，目的片段大約861 bp。將穿梭載體pAd-Track用EcoRⅤ和XhoⅠ雙酶切后獲得的骨架片段與EcoRⅤ和XhoⅠ酶切后的Hes1基因片段連接，構建pAd-Track-Hes1載體，并測序驗證。將PmeI線性化后的pAd-Track-Hes1載體轉化入經(jīng)氯化鈣制備的BJ5183感受態(tài)細胞，獲得重組后的腺病毒載體pAd-Hes1，見圖1。

1.3 重組腺病毒的包裝、擴增與滴度測定

用Lipofectamine 2000轉染試劑將PacⅠ酶切后的重組腺病毒載體pAd-Hes1導入大約50%融合生長的293A細胞。當出現(xiàn)完全細胞病變效應（cytopathic effect,CPE）時，收集細胞，-80℃、37℃反復凍融3次，釋放Ad-Hes1病毒顆粒，將病毒懸液置于-80℃保存，見圖1。取適量的上述病毒懸液再次感染293A細胞，在293A細胞中大量擴增重組腺病毒顆粒，擴增后的腺病毒分裝保存于-80℃。由于pAd-Track載體自身攜帶GFP的報告基因，細胞感染病毒24 h后，通過流式細胞儀測定表達GFP的細胞數(shù)來測定病毒滴度。病毒滴度（GFU/ml）=（GFP陽性細胞百分比×細胞總數(shù)）/[感染病毒的體積（ml）×病毒稀釋倍數(shù)]。

圖1 Hes1重組腺病毒載體構建、病毒包裝示意圖Figure 1 Schema of construction of Hes1 recombinant adenovirus vector and generation of adenovirus in 293A packaging cells

1.4 細胞Hes1基因表達水平的檢測

感染Ad-Hes1病毒的Hep1-6細胞為實驗組（Hep1-6-Hes1），感染Ad-GFP病毒的Hep1-6細胞為陰性對照組（Hep1-6-GFP），未感染病毒Hep1-6細胞為空白對照組（Hep1-6-BLK）。采用Real-time PCR和Western blot分別檢測Hes1 mRNA和蛋白的表達。Real-time PCR檢測Hes1 mRNA時，PBS洗滌細胞后加入TRIzol裂解液提取總RNA，用M-MLV將RNA反轉錄為第一鏈cDNA，再進行Real-time PCR檢測Hes1基因的表達，GAPDH作為內參基因，Hes1相對表達量的變化采用2-ΔΔCt法計算，Real-time PCR所用引物序列為：Hes1正向引物：5’-ACACCGG ACAAACCAAAGACGGCCT-3’，Hes1反向引物：5’-CCCGCTGCAGGTTCCGGAGGTGCTTC-3’，GAPDH正向引物：5’-GGTGAAGGTCGGTGTGA ACG-3’，GAPDH反向引物：5’-CTCGCTCCTGGA AGATGGTG-3’。Western blot檢測蛋白表達時，用RIPA緩沖液提取細胞總蛋白，BCA法測定總蛋白濃度，每樣本取50 μg蛋白進行SDS-PAGE電泳分離，隨后將蛋白轉移至PVDF膜。用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h后，兔抗小鼠Hes1多克隆抗體（1:2000）4℃孵育過夜，PBS漂洗3次，每次10 min；加辣根過氧化物酶標記的二抗（1:500）37℃孵育30 min，PBS漂洗3次。然后，與ECL試劑反應2 min，在暗室中進行X線膠片曝光、顯影和定影。

1.5 細胞增殖和克隆形成實驗

取生長良好的Hep1-6細胞，以5×103/孔接種于96孔板，培養(yǎng)24 h，每孔加入復合感染指數(shù)（MOI）=10的病毒懸液25 μl。當測定生長速率時，每孔加入10%體積的CCK-8溶液37℃培養(yǎng)2 h，用酶標儀測450 nm的吸光度。每組實驗設置三個復孔，計算平均值，并繪制生長曲線。將500個感染病毒24 h后的細胞接種于3.5 cm培養(yǎng)皿，37℃、5%CO2培養(yǎng)2周，用4%多聚甲醛溶液固定10 min，以錐蟲藍染色，計數(shù)克隆數(shù)。

1.6 劃痕愈合實驗

在6孔板中接種約5×105個細胞，待細胞長滿后，用200 μl吸頭垂直于培養(yǎng)板底劃一直線，用PBS洗3次去除劃痕時脫落的細胞，加入無血清培養(yǎng)基放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。按0、24、48 h拍照測量劃痕的寬度。創(chuàng)面愈合率=（0 h劃痕的寬度-指定測量時間劃痕的寬度）/0 h劃痕的寬度。

1.7 Transwell遷移與遷襲實驗

在24孔板中，每孔加入500 μl含20%FBS DMEM培養(yǎng)基，然后在孔中放置Transwell小室（遷襲實驗時，在Transwell小室中應提前鋪入Matrigel基質膠）。胰酶消化處于對數(shù)生長期的細胞，并用10%FBS DMEM培養(yǎng)基重懸細胞并調整細胞密度至5×104/ml，接種200 μl細胞懸液于Transwell小室中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h，去除Transwell小室并吸棄24孔板中的培養(yǎng)液，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定10 min，用PBS洗3次，結晶紫染色10 min，用PBS洗3次，顯微鏡下觀察，并對遷移至小室底部24孔板內的細胞進行拍照和計數(shù)，每個孔均隨機選取10個視野計數(shù)，求平均值，每組實驗重復3次。

1.8 統(tǒng)計學方法

使用GraphPad Prism6.0軟件分析數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)結果以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，多個樣本均數(shù)間的多重比較采用LSD-t檢驗，配對樣本采用雙尾Student's檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 腺病毒載體的鑒定

構建的穿梭載體pAd-Track-Hes1經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，酶切片段為3 720 bp和6 182 bp；重組后的腺病毒載體Ad-Hes1經(jīng)PacⅠ酶切鑒定，酶切片段為4 500 bp和23 000 bp，見圖2，與預期相符，測序結果證實Hes1未發(fā)生突變。

2.2 重組腺病毒的包裝與滴度測定

通過Lipofectamine 2000將PacⅠ線性化后的腺病毒載體PAd-Hes1轉染至50%融合的293A細胞中，轉染1天后在熒光顯微鏡下可見GFP陽性的細胞約占50%；細胞繼續(xù)培養(yǎng)到8天時，GFP陽性的細胞約為90%，同時293A細胞開始出現(xiàn)CPE效應；培養(yǎng)到14天時，293A細胞出現(xiàn)完全CPE效應，細胞漂浮于培養(yǎng)液中呈現(xiàn)“葡萄串樣”，見圖2B。此時，離心收集細胞，反復凍融釋放病毒顆粒。將擴增后的病毒懸液稀釋1×104和1×105倍后，分別以500 μl感染6孔板中293A細胞24 h后，胰酶消化收集細胞并計數(shù)每孔中的細胞總數(shù)，其數(shù)量分別為9.6×105和8.2×105個，流式細胞儀檢測綠色熒光陽性細胞的陽性率分別為54.65%和7.92%，見圖2C，病毒滴度為1.04×1010和1.29×1010，病毒滴度平均為1.17×1010GFU/ml。

2.3 腺病毒介導Hes1基因在Hep1-6細胞中的表達

在Hep1-6細胞感染病毒24 h后報告基因GFP開始表達，見圖3A～B，36 h后收集細胞提取總RNA和蛋白。Real-time PCR檢測結果顯示，感染Ad-Hes1病毒的Hep1-6細胞的Hes1 mRNA表達量顯著上調，約為陰性對照Hep1-6-GFP和空白對照Hep1-6-BLK細胞的95倍，見圖3C。同時Western blot檢測結果表明感染Ad-Hes1病毒的Hep1-6細胞Hes1蛋白表達量強于陰性對照Hep1-6-GFP和空白對照Hep1-6-BLK細胞，見圖3D。

2.4 Hes1抑制Hep1-6細胞的增殖

克隆形成實驗表明，與感染Ad-GFP的對照組比較，感染Ad-hes1的細胞形成的克隆較小，且克隆數(shù)量明顯減少，見圖4A，感染Ad-Hes1的Hep1-6克隆形成數(shù)為（42±5）個，感染Ad-GFP的對照組為（185±35）個（P<0.001），見圖4B。在外源過表達Hes1第3天，Hep1-6細胞增殖開始受到抑制，見圖5A，而第5天時細胞活性明顯下降，僅為對照細胞的55%（P<0.01），見圖5B。

2.5 Hes1抑制Hep1-6細胞的遷移與侵襲

圖2 Hes1腺病毒載體的酶切鑒定、病毒包裝和滴度測定Figure 2 Identification of Hes1 adenovirus vectors by enzyme digestion and the package and titer determination of adenovirus

圖3 腺病毒介導Hes1基因在Hep1-6細胞中的表達Figure 3 Adenovirus-mediated Hes1 gene expression in Hep1-6 cells

圖4 Hes1抑制Hep1-6細胞的克隆形成能力Figure 4 Hes1 inhibited clonogenic capacity of Hep1-6 cells

圖5 Hes1抑制Hep1-6細胞的增殖能力Figure 5 Hes1 inhibited proliferation of Hep1-6 cells

細胞劃痕實驗顯示，感染Ad-Hes1的Hep1-6細胞在24、48 h劃痕愈合率分別為0.1和0.12，顯著低于感染Ad-GFP的對照組（0.18和0.26），見圖6A；Transwell遷移實驗結果顯示，感染Ad-Hes1的Hep1-6細胞接種入Transwell小室48 h后遷移進入Transwell下室的細胞數(shù)量為102個，顯著低于感染Ad-GFP的對照組（222個），見圖6B；Transwell侵襲實驗結果顯示，感染Ad-Hes1的Hep1-6細胞接種入鋪有Matrigel基質膠的Transwell小室48 h后，侵襲突破基質膠進入Transwell下室的細胞數(shù)目為38個，顯著低于感染Ad-GFP的對照組（65個），見圖6C。劃痕愈合實驗和Transwell遷移與侵襲實驗結果表明Hes1能明顯降低Hep1-6細胞的體外遷移和侵襲能力。

3 討論

Notch信號通路是進化上高度保守的細胞間信號通路，在調節(jié)細胞分化、增殖和凋亡及一系列生理、病理過程中起著重要作用[13-14]。目前已有許多研究表明，Notch受體的異常表達和激活與多種腫瘤的發(fā)生相關[15-16]。在大多數(shù)HCC中Notch信號通路的重要因子Notch1和Jagged1的表達發(fā)生明顯異常[17]。其中Hes1作為Notch通路下游重要的效應因子越來越受到人們的關注。

Hes1作為Notch的信號通路的效應因子之一，Hes1可由典型和非典型Notch途徑激活，但Hes1也可被hedgehog信號途徑和其他不同的途徑所激活，因此，Hes1位于多種信號通路的交叉點上，被認為是治療多種疾病的一個極好的中心靶點[18]。Hes1蛋白包含3個保守結構域：bHLH、Orange和Trp-Arg-Pro-Trp（WRPW）結構域。Hes1通過bHLH結構域介導N box（CACNAG）和WRPW結構域與分裂蛋白轉導素樣增強子（transducin-like enhancer of split,TLE）相互作用而發(fā)揮轉錄抑制作用，Hes1主要通過抑制p21kip1、p57kip2、PCNA、E2F1和CDKN1A等基因的表達來抑制細胞周期的進展[19]。

Hes1在不同類型腫瘤中的功能和其作用機制截然不同，對某些類型的腫瘤來說，Hes1可能有抑制增殖或誘導分化的作用，如在急性髓性白血?。╝cute myeloid leukemia,AML）細胞中，Hes1的表達通過促進p21的表達，進而引起AML細胞的細胞周期阻滯和細胞凋亡[20]，而在小鼠畸胎瘤細胞P19干細胞中，維甲酸（Retinoic Acid,RA）誘導Hes1表達上調后則誘導P19細胞向神經(jīng)細胞分化[21]。而在人肝癌細胞系HepG2和SNU398中，Hes1通過負向調節(jié)CDKN1C/P57促進肝癌細胞的衰老[22]。因此，Hes1基因在不同腫瘤中獨特的生物學特性使其有可能成為腫瘤預警或治療的突破點。

本研究利用腺病毒系統(tǒng)在HCC細胞系Hep1-6中成功介導了外源Hes1基因的表達。Hes1過表達后明顯抑制了Hep1-6細胞的增殖并使其克隆形成能力下降，同時，Hes1也使Hep1-6細胞在體外的遷移與侵襲能力明顯下降。因此，進一步深入研究Hes1在肝細胞癌發(fā)生中的作用及其作用的機制，可以為肝細胞癌的預防或治療提供新的干預靶點。

圖6 Hes1抑制Hep1-6細胞的遷移和侵襲能力Figure 6 Hes1 inhibited migration and invasion of Hep1-6 cells