馬麗娟，周恩，鄒聯(lián)洪，尹娟，肖旭平

0 引言

喉鱗狀細胞癌為耳鼻喉科常見的惡性腫瘤，主要治療手段為手術(shù)、放療及輔助化療等，但總體生存率不高[1]。探索喉癌發(fā)生、發(fā)展過程中的分子機制，尋找有效的分子標志物進行靶向診斷與治療，提高喉癌患者的生存率是腫瘤基礎(chǔ)與臨床研究的重要內(nèi)容。高遷移率族蛋白2（high-mobility group A2,HMGA2）為一種新的癌基因，在多種腫瘤中高表達，與腫瘤患者的預(yù)后緊密相關(guān)[2]。miRNA let-7a可與原癌基因c-MYC[3]、HMGA2[4]和RAS[5]等的3'非編碼翻譯區(qū)結(jié)合從而抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯，進一步調(diào)控其表達。目前關(guān)于let-7a調(diào)控HMGA2在喉癌的發(fā)生及侵襲轉(zhuǎn)移中的機制研究報道甚少，本課題組前期在人喉癌組織中的研究發(fā)現(xiàn)[6]，let-7a和HMGA2與喉癌的增殖及侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系緊密。本研究中，我們在細胞水平和體內(nèi)試驗證實let-7a通過負性調(diào)控HMGA2的表達從而影響喉癌細胞的增殖，為進一步研究喉癌的侵襲轉(zhuǎn)移及分子靶向治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

人喉鱗癌細胞株TU212購自中科院上海細胞所。BALB/C雄性裸鼠（4～6周齡，體質(zhì)量10～20 g）18只，購自南京大學(xué)-南京生物醫(yī)藥研究院，飼養(yǎng)于湖南師范大學(xué)動物實驗中心、恒溫18℃～22℃、恒濕度（50%～80%）的SPF級環(huán)境。隨機分為三組：空白對照組（blank control組）、let-7a NC組及l(fā)et-7a mimics組，每組各6只。let-7a mimics由上海吉瑪制藥公司合成；轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體LipofectamineTM2000來自上海索寶生物科技有限公司；Ⅰ抗HMGA2兔抗人抗體、Ⅱ抗羊抗兔HRP（辣根過氧化物酶）抗體及內(nèi)參β-actin均購自美國Proteintech公司；DMED培養(yǎng)液、胰酶、胎牛血清購自上海依科賽生物公司；實時熒光定量PCR二步法試劑盒及DAB試劑盒購自北京中杉金橋生物公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒及miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京康為世紀生物公司；SYBGREEN PCR Mix購自美國Invitrogen公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

TU212細胞置于含10%胎牛血清、100 u/ml青霉素和100 mg/ml鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)（37℃、5%CO2）。

1.3 細胞轉(zhuǎn)染

根據(jù)試劑盒說明書進行轉(zhuǎn)染，采用陽離子脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染細胞。對轉(zhuǎn)染效率超過50%的細胞進行傳代培養(yǎng)。

1.4 細胞增殖實驗

取培養(yǎng)好的細胞，三組均設(shè)4個復(fù)孔，MTT法檢測細胞活力，分別在培養(yǎng)12、24、48、72 h于Bio-Tek酶標儀分析490 nm處吸光度（OD）值，取均值并繪制生長曲線。EdU增殖實驗：接種空白對照、let-7a陰性對照（NC）和轉(zhuǎn)染let-7a mimics的喉癌細胞TU212于24孔板中，每組細胞設(shè)置3個復(fù)孔，待細胞生長至對數(shù)生長期時加入50 μmol/L EdU試劑，培養(yǎng)2 h，4%多聚甲醛固定，0.25%Triton X破膜，Apollo染色和Hoechst染核，顯微鏡下拍照，并隨機挑選顯微鏡下視野，計數(shù)200個細胞，記錄EdU陽性細胞的比例，實驗重復(fù)3次，并進行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.5 建立荷瘤裸鼠動物模型

分別取轉(zhuǎn)染后生長良好的TU212細胞，抽取0.2 ml（含5×106個細胞）懸浮液對裸鼠進行右側(cè)背部皮下注射，let-7a mimics組注射TU212-let-7a mimics細胞，let-7a NC組注射TU212-let-7a mimics NC細胞，空白對照組注射TU212細胞，建立人喉癌細胞裸鼠皮下移植瘤模型。自接種日起，每日觀察并記錄移植瘤發(fā)生時間、裸鼠的健康和成瘤情況。成瘤后根據(jù)公式V=ab2/2計算腫瘤體積，觀察終點設(shè)為30天，繪制生長曲線圖。第30 d處死各組裸鼠終止實驗，切除瘤體電子秤稱重，測量質(zhì)量和大小，計算抑瘤率。抑瘤率（%）=（1-實驗組平均瘤重/對照組平均瘤重）×100%。

1.6 實時熒光定量PCR檢測HMGA2的mRNA和let-7a miRNA的表達

按相關(guān)試劑盒說明書的步驟操作，以多聚A加尾法對目的基因進行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物加入let-7a與U6、HMGA2與β-actin的基因引物及熒光染料，進行RT-qPCR反應(yīng)。采用2-ΔΔCt法進行相對定量。U6的引物序列為5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3；let-7a的引物序列為5’-CTATACAACCTACTGCCTTCCC-3’；HMGA2的上游引物序列為5’-CAGCCCAGGGACAACCT-3’，下游引物序列為5’-CTGCCTCTTGGCCGTTT-3’；β-actin的上游引物序列為5’-ATCCTGCGTCTGGACCTGG-3’，下游引物序列為5’-TAATGTCACGCACGATTTCC-3’。

1.7 Western blot法檢測HMGA2蛋白的表達

提取組織總蛋白，根據(jù)BCA蛋白定量試劑盒說明書操作測定蛋白濃度。Ⅰ抗HMGA2的稀釋濃度為1:1 000，β-actin（稀釋濃度1:4 000）為內(nèi)參。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 let-7a抑制喉癌細胞TU212的增殖

RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，與空白對照組和let-7a NC組比，轉(zhuǎn)染let-7a mimics的喉癌細胞中l(wèi)et-7a的表達水平顯著增加，見圖1A，證實喉癌細胞中l(wèi)et-7a過表達成功。MTT實驗結(jié)果提示，與空白對照組和let-7a NC組相比，在轉(zhuǎn)染let-7a mimics后，喉癌TU212細胞的增殖能力受到抑制，72 h時增殖能力顯著降低（P=0.023），見圖1B，提示上調(diào)let-7a的表達可抑制喉癌TU212細胞的生長。

采用EdU細胞增殖實驗檢測了空白對照組、let-7a NC組和let-7a mimics組中的S期細胞的比例，見圖1C～D，過表達let-7a的喉癌細胞TU212相對于空白對照組和let-7a NC組，S期細胞數(shù)的比例明顯減少，進一步證實let-7a抑制喉癌細胞TU212的增殖。

2.2 let-7a下調(diào)TU212細胞中HMGA2的表達

空白對照組、let-7a NC組和let-7a mimics組HMGA2 mRNA相對表達量分別為1.274±0.055、1.289±0.051、0.624±0.087；提示在TU212細胞中過表達let-7a可降低HMGA2的轉(zhuǎn)錄水平，見圖2A。Western blot實驗結(jié)果同樣證實與空白對照組和let-7a NC組相比，let-7a異常表達的TU212細胞中HMGA2的蛋白表達降低，見圖2B～C。

2.3 體內(nèi)驗證let-7a抑制喉癌細胞TU212的增殖

空白對照組、let-7a NC組、let-7a mimics組TU212細胞成瘤體積，見圖3A～B，相對于空白對照組和let-7a NC組，let-7a過表達的TU212細胞的成瘤組織體積明顯降低，提示let-7a抑制喉癌的增殖。在TU212細胞的裸鼠成瘤實驗中，空白對照組、let-7a NC組和let-7a mimics組TU212細胞的成瘤組織中l(wèi)et-7a mRNA的相對表達水平分別為1.519±0.717、1.485±0.438、2.490±0.526，提示轉(zhuǎn)染let-7a mimics的TU212細胞的成瘤組織中l(wèi)et-7a成功過表達，見圖3C。

繪制成瘤組織的體積生長曲線發(fā)現(xiàn)，let-7a過表達的TU212細胞的成瘤組織的體積增長水平明顯低于對應(yīng)時間點的空白對照組和let-7a NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.002），見圖3D。

2.4 let-7a過表達的TU212成瘤組織中HMGA2的mRNA和蛋白水平降低

RT-qPCR和Western blot實驗結(jié)果提示，與空白對照組和let-7a NC組比較，let-7a mimic組中HMGA2的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平顯著下調(diào)，見圖4。

圖1 let-7a在喉癌細胞的表達及在EdU細胞增殖實驗中的增殖情況Figure 1 Expression of let-7a miRNA in laryngeal carcinoma cells and its proliferation in EdU cell proliferation experiment

圖2 HMGA2在喉癌細胞中的表達情況Figure 2 HMGA2 expression in laryngeal carcinoma cells

圖3 裸鼠移植瘤的成瘤情況及l(fā)et-7a在裸鼠移植瘤組織中的表達Figure 3 Formation of xenograft in nude mice and let-7a expression in xenograft tissues

圖4 HMGA2在裸鼠移植瘤組織中的表達情況Figure 4 HMGA2 expression in xenograft tissues in nude mice

3 討論

喉癌的發(fā)病率在耳鼻喉科惡性腫瘤中居第三位，且呈逐年上升趨勢[7]。目前已知喉癌的病因與遺傳、環(huán)境及不良習(xí)慣等諸多因素密切相關(guān)，但具體發(fā)病機制尚未闡明[8]。深入探討喉癌發(fā)生發(fā)展與侵襲轉(zhuǎn)移的發(fā)病機制，尋找有效的阻斷靶點并較好地應(yīng)用于該病的預(yù)防、診斷及分子靶向治療是我們亟待解決的問題。

let-7是目前研究較為廣泛的miRNA之一，最早在線蟲中發(fā)現(xiàn)，其序列、表達模式、調(diào)控功能均具有高度保守性。最新研究證明let-7a可以抑制腫瘤周圍微血管的形成，造成腫瘤組織內(nèi)的乏氧狀態(tài)及腫瘤微環(huán)境的破壞，從而抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移[9]。HMGA2是一種非組蛋白染色體蛋白，能通過與染色質(zhì)結(jié)合而改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)，被公認為是一種新的癌基因，可能與調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄以及破壞DNA修復(fù)系統(tǒng)等相關(guān)[10]。研究報道在食管癌[11]、口腔鱗癌[12]、頭頸鱗癌[13]等腫瘤中均發(fā)現(xiàn)let-7靶向負調(diào)控HMGA2的表達，并與惡性腫瘤的侵襲密切相關(guān)。Kuma等[14]在肺癌的實驗中通過制作一系列HMGA2的表達結(jié)構(gòu)，驗證了HMGA2的3'UTR可作為TGF-β的ceRNA，通過競爭性結(jié)合抑瘤性miRNA let-7，增強TGF-β信號通路，最終促進肺癌細胞的增殖、轉(zhuǎn)移。但關(guān)于let-7a調(diào)控HMGA2對喉癌增殖、侵襲的影響及其機制研究鮮見相關(guān)報道。

本研究MTT法檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)let-7a可明顯抑制細胞的活力。RT-qPCR法檢測TU212細胞內(nèi)let-7a和HMGA2 mRNA的表達情況發(fā)現(xiàn)，1et-7a mimics組中l(wèi)et-7a的表達量明顯高于let-7a NC組和空白對照組，而HMGA2 mRNA的表達受到抑制；Western blot法檢測細胞中HMGA2蛋白的表達，其結(jié)果與mRNA的結(jié)果一致，這表明let-7a可有效抑制細胞中HMGA2的轉(zhuǎn)錄和翻譯。在TU212細胞株的體外成瘤實驗中，1et-7a mimics組裸鼠皮下腫瘤生長速度較其他兩組明顯減慢，且瘤體體積均顯著小于其他兩組，提示let-7a對裸鼠皮下移植瘤的生長有明顯抑制作用，進一步證實let-7a抑制喉癌的增殖。RT-qPCR和Western blot法檢測成瘤組織中HMGA2的表達水平，與細胞實驗結(jié)果完全一致，進一步提示let-7a能夠負向調(diào)控HMGA2的表達，抑制腫瘤的生長。研究發(fā)現(xiàn)let-7a能夠靶向調(diào)控HMGA2的表達機制是HMGA2基因重排過程中丟失了包括3’端的非翻譯區(qū)（3’UTR）在內(nèi)的酸性羧基尾端，從而使1et-7a對HMGA2失去靶向抑制功能和沉默作用，進而使HMGA2異常激活，促進腫瘤的侵襲性生長[15]。

綜上所述，本研究通過瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建了喉癌TU212細胞內(nèi)let-7a高表達的狀態(tài)，在細胞水平證實let-7a負向調(diào)控HMGA2基因的表達，抑制喉癌TU212細胞的增殖；成功構(gòu)建了人喉癌TU212細胞裸鼠移植瘤模型，證實let-7a靶向調(diào)控HMGA2蛋白的表達，從而抑制了喉癌細胞的生長，為進一步探討喉癌的增殖影響機制及分子靶向治療提供了理論依據(jù)。