宋敏 鞏彥龍 董萬濤 劉小鈺 董平,3 黃凱 王凱

1.甘肅中醫(yī)藥大學，甘肅 蘭州 730000 2.甘肅中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730020 3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010

在全世界老齡化的背景下，老年性骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)的發(fā)病率呈遞增趨勢，其中絕經(jīng)后OP性骨折的終生風險可能在13%～25%，并且隨著壽命的增長而增加了骨折的風險[1]。多種因素影響了骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)向成骨細胞(osteoblast，OB)的分化[2]，而OP發(fā)生、發(fā)展與OB及破骨細胞(osteoclast，OC)調(diào)控的骨代謝動態(tài)平衡失調(diào)密切相關(guān)。目前，治療OP的西藥在治療的同時又有某種不理想因素；而中醫(yī)藥通過中醫(yī)藥理論的指導(dǎo)，對人體機能的全方位調(diào)節(jié)防治OP，療效顯著、副作用小，對OP的防治有積極作用。本研究通過定向誘導(dǎo)BMSCs向OB分化模型，運用固本增骨方含藥血清對其定向分化過程的干預(yù)，以觀察固本增骨方含藥血清對該過程的影響并闡明影響該過程的可能機理。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1動物與細胞：SPF級3月齡Wistar大鼠30只，體重(200±20) g；Wistar大鼠BMSCs(貨號：RAWMX-01001，規(guī)格：1×106個細胞/管；凍存代次：P1；保存條件：液氮)。

1.1.2主要藥品與試劑：購于甘肅中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院的固本增骨方，制成藥粉后配成25 g/L混懸液。濃度為0.1%的明膠(貨號：RAWMX-90011，RAWMX-90021，T170313G001)。SDS-PAGE試劑盒、茜素紅(批號：20170802，p1200，T170512G001)。購于GeneTex公司的BGP兔多克隆抗體(批號：821703974)，購于ImmunoWay公司的Runx2兔多克隆抗體、GAPDH(批號：B4135，B5601)。

1.1.3主要儀器：凝膠電泳儀、凝膠成像分析儀(美國 Bio-rad公司生產(chǎn)，PowerPoc Basic，ChemiDocTMXRS+)及PCR熒光定量儀(C1000)。

1.2方法

1.2.1固本增骨方含藥血清的制備：上述動物按隨機表法分為空白血清組和含藥血清組(各15只)，后者以10 mL/kg劑量、2次/d灌胃，前者給予等量生理鹽水，干預(yù)一周后心臟取血，離心取上清滅火、除菌后備用。

1.2.2Wistar大鼠BMSCs的培養(yǎng)：BMSCs經(jīng)復(fù)蘇，培養(yǎng)后重懸，臺盼藍染色觀察適宜密度為3.0×104個活細胞/cm2，將細胞接種分瓶后在條件適宜的培養(yǎng)箱中傳代，最終培養(yǎng)出符合實驗要求BMSCs。

1.2.3分組與造模：將傳至P3代BMSCs分為空白血清組、傳統(tǒng)成骨誘導(dǎo)組、傳統(tǒng)成骨誘導(dǎo)+不同濃度(5%、10%、20%、30%)含藥血清組。將上述細胞接種于相應(yīng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)基，并依次按實驗分組分別加入空白血清、傳統(tǒng)成骨誘導(dǎo)液及傳統(tǒng)成骨誘導(dǎo)液+各濃度含藥血清繼續(xù)培養(yǎng)。從24 h后開始連續(xù)5 d測量各組細胞計數(shù)。

1.2.4茜素紅染色：4周后甲醛固經(jīng)茜素紅染色后，光鏡下觀察鈣結(jié)節(jié)數(shù)。

1.2.5細胞BGP、Runx2蛋白表達檢測：提取各組細胞總蛋白保存后備用，每組BGP、Runx2蛋白檢測均按照WB標注操作步驟進行，并分析各組條帶，所得灰度值與內(nèi)參比較得到BGP、Runx2的蛋白相對表達量。

1.2.6細胞BGP、Runx2 mRNA表達的檢測：TRIZOL法提取各組總RNA、測定含量。取總RNA 2μg，逆轉(zhuǎn)錄合成規(guī)范操作第一鏈cDNA。擴增片段長度150 bp、86 bp、51 bp分別對應(yīng)GAPDH、BGP、Runx2。按熒光定量試劑盒操作流程行RT-PCR反應(yīng)及PCR擴增。將所得數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

1.3統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1BMSCs培養(yǎng)結(jié)果

細胞傳至第三代時可見其呈順向排列生長，并且生長良好，見圖1。

圖1 P1、P2、P3代BMSCs鏡下形態(tài) A：P1代BMSCs培養(yǎng)5 d(×10)；B：P2代BMSCs培養(yǎng)5 d(×10)；C：P3代BMSCs培養(yǎng)5 d(×10)。Fig.1 Microscopic morphology of P1, P2 and P3 BMSCs. A: P1 BMSCs were cultured for 5 days (× 10); B: P2 BMSCs were cultured for 5 days (× 10); C: P3 BMSCs were cultured for 5 days (× 10).

2.2各組細胞茜素紅染色結(jié)果比較

鏡下觀察可見傳統(tǒng)成骨誘導(dǎo)組紅色鈣結(jié)節(jié)數(shù)量明顯多于空白組；含藥血清組(5%、10%、20%)隨著濃度增加，紅色鈣結(jié)節(jié)數(shù)量也逐漸增加，尤其濃度在20%時，紅色鈣結(jié)節(jié)數(shù)量最為顯著，且顯著高于空白組與傳統(tǒng)成骨誘導(dǎo)組，當濃度增加到30%時，鈣結(jié)節(jié)數(shù)量呈下降趨勢，結(jié)果見圖2。

圖2 各組細胞茜素紅染色結(jié)果(×40) A：5%含藥血清組；B：10%含藥血清組；C：20%含藥血清組；D：30%含藥血清組；E：空白血清組；F：傳統(tǒng)成骨誘導(dǎo)組。Fig.2 Alizarin red staining results of cells in each group (×40). A: 5% drug-containing serum group; B: 10% drug-containing serum group; C: 20% drug-containing serum group; D: 30% drug-containing serum group; E: Blank serum group; F: Traditional osteogenesis induction group.

2.3各組細胞BGP、Runx2蛋白表達比較(圖3，表1)

2.4各組細胞BGP、BGP mRNA表達比較(表2)

3 討論

年齡增長骨量和骨骼強度下降，在老年以后伴隨著量減少和骨骼強度下降后骨細胞死亡增快而骨細胞新生相對減少，這包括OC導(dǎo)致的破骨細胞作用占主要地位，而OB的成骨作用減低，并且導(dǎo)致骨細胞死亡是多因素作用的結(jié)果[3]。老年婦女中的OP患者因OP可直接導(dǎo)致髖部骨折及椎體壓縮性骨折，對于大多數(shù)患有骨質(zhì)疏松癥的婦女來說，早起治療具有積極的意義[4]。BMSCs是有著多向分化潛能的干細胞，在細胞因子、基因等因素的作用下其可以分化為OB[5]，而調(diào)上述因素對BMSCs調(diào)節(jié)異常將導(dǎo)致骨量丟失和OP發(fā)生[6]。研究顯示，BMSCs的異常分化能促進或抑制骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生[7]。

圖3 各組細胞BGP、Runx2蛋白表達注：A、B、C、D分別為5%、10%、20%、30%含藥血清組；E為空白血清組；F為傳統(tǒng)成骨誘導(dǎo)組Fig.3 Expression of BGP and Runx2 in cells of each group

組別BGP/GAPDHRunx2/GAPDH5%含藥血清組0.76±0.04Δ0.88±0.08Δ10%含藥血清組0.85±0.07Δ1.00±0.03Δ20%含藥血清組1.04±0.11Δ▲1.10±0.05Δ▲30%含藥血清組0.82±0.02Δ0.85±0.09Δ空白組0.72±0.050.81±0.14傳統(tǒng)成骨誘導(dǎo)組0.74±0.04Δ0.83±0.01ΔF值10.0515.770P值0.0010.006

注：與空白組比較，ΔP<0.01；與5%、10%、30%含藥血清組及傳統(tǒng)成骨誘導(dǎo)組比較，▲P<0.01。

組別BGPRunx25%含藥血清組1.82±0.24Δ1.24±0.29Δ10%含藥血清組2.05±0.32Δ1.6±0.18Δ20%含藥血清組2.95±0.22Δ▲2.18±0.20Δ▲30%含藥血清組1.68±0.191.06±0.15Δ空白組1.00±0.001.00±0.00傳統(tǒng)成骨誘導(dǎo)組1.63±0.30Δ1.02±0.27ΔF值10.51011.898P值0.0000.000

注：與空白組比較，ΔP<0.01；與5%、10%、30%含藥血清組及傳統(tǒng)成骨誘導(dǎo)組比較，▲P<0.01。

本實驗研究結(jié)果顯示，大鼠P1代BMSCs復(fù)蘇后鏡下觀察可見呈短梭形貼壁生長；BMSCs培養(yǎng)符合實驗要求。茜素紅可識別細胞內(nèi)的鈣鹽[8]，本實驗中BMSCs經(jīng)28 d成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后行茜素紅染色，鏡下見紅色鈣結(jié)節(jié)數(shù)量隨含藥血清濃度增加(5%、10%、20%)而增加，在濃度為20%時紅色鈣結(jié)節(jié)數(shù)量最多，并且明顯多于空白組與傳統(tǒng)成骨誘導(dǎo)組，但當含藥血清濃度為30%時，紅色鈣結(jié)節(jié)數(shù)量下降，這與最佳藥物濃度有關(guān)。非膠原蛋白BGP可特異性地標志骨形成，在骨形成、維持骨量、骨重塑時，BGP的重要作用是一方面其能抑制異常羥磷灰石結(jié)晶的形成，另一方面其能促進軟骨的礦化速率[9]。Komori等[10]首次報道了由于缺乏Runx2因子而引起成骨細胞不成熟，進而缺乏膜內(nèi)和軟骨內(nèi)骨化。Runx2在骨形成期間調(diào)節(jié)成骨細胞和軟骨細胞的分化，是BMSCs成骨分化的關(guān)鍵因子及骨形成的標志基因[11]。本實驗研究結(jié)果顯示，BGP、Runx2基因及蛋白的表達在20%濃度含藥血清組達水平呈現(xiàn)峰值。由本研究結(jié)果可見，固本增骨方含藥血清能通過促進BMSCs中BGP、Runx2基因轉(zhuǎn)錄及蛋白的表達，誘導(dǎo)BMSCs向成骨細胞分化，并且當含藥血清濃度為20%時這種誘導(dǎo)作用較明顯。

從20世紀60年代，更年期和骨質(zhì)疏松之間的聯(lián)系首次被確認，此后雌激素治療OP成為預(yù)防骨丟失的重要措施之一[12]。截至目前，基于對骨生物學的理解，西醫(yī)對OP的治療主要包括抑制骨吸收藥及促進骨形成藥，對因治療方法單一并且在一定方面不理想。中藥在“整體觀、辨證論治”指導(dǎo)治療OP時，著眼于對機體整個機能的調(diào)節(jié)，標本兼顧，取得了良好的療效。固本增骨方是甘肅中醫(yī)藥大學宋敏教授基于中醫(yī)理論從“脾腎”論治而治療OP多年的經(jīng)驗方，由炙黃芪、白條黨參、岷當歸、炙淫羊藿、燙狗脊、鹽補骨脂組成，諸藥合用，能益氣健脾、補腎壯骨、活血通絡(luò)之功效，標本兼顧[13]，能有效緩解老年脾腎兩虛型骨質(zhì)疏松癥狀。