張志達 沈耿楊 任輝 余翔 尚奇 黃錦菁 招文華 余佩沅 詹玫琦 梁德 楊志東 江曉兵*

1.廣州中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，廣東 廣州 510405 2. 廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院脊柱骨科，廣東 廣州 510405 3. 廣州中醫(yī)藥大學嶺南醫(yī)學研究中心，廣東 廣州 510405

糖皮質(zhì)激素(glucocorticoids，GCs)具有良好的抗炎、抗過敏、抑制免疫等作用，廣泛應(yīng)用于臨床。但長期、超生理劑量攝入GCs可引發(fā)骨質(zhì)疏松。GCs攝入是導致繼發(fā)性骨質(zhì)疏松最常見的因素[1]。骨髓間充質(zhì)干細胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)可向成骨細胞、脂肪細胞等多方向分化，直接影響骨形成，調(diào)節(jié)骨量。GCs可抑制BMSC成骨分化、促進BMSCs成脂分化[2]。木通皂苷D(akebia saponin D，ASD)又稱川續(xù)斷皂苷VI，是川續(xù)斷的主要活性成分[3]，研究顯示ASD可促進BMSCs向成骨細胞分化[4]。BMP/Smad信號通路可調(diào)控成骨細胞的全部過程，其功能障礙可引起骨形成減少[5]。因此，本研究擬通過研究ASD對在GC環(huán)境下小鼠BMSC成骨分化的影響，為今后ASD在防治GIOP中的開發(fā)應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1細胞提取、培養(yǎng)與傳代

8周齡健康C57BL/6小鼠脫頸法處死，70%酒精浸泡消毒5 min，切開髖關(guān)節(jié)周圍的皮膚，用無菌的解剖剪刀和鑷子從每只小鼠后肢分離出股骨和脛骨，去除皮膚、肌肉肌腱等軟組織，將干凈的骨頭放在培養(yǎng)皿中。無菌剪刀剪除每根骨的兩端，暴露骨髓腔，用1 mL注射器抽取沖洗培養(yǎng)基(49 mL α-MEM+1 mL FBS+0.5 mL P/S)沖出骨髓至15 mL離心管。室溫下以1 000 r/min離心10 min，棄上清液，室溫下將細胞懸浮于5 mL紅細胞裂解緩沖液中5 min。用10 mL沖洗培養(yǎng)基再洗細胞1次并離心，用1 mL沖洗培養(yǎng)基重新懸浮細胞，計算細胞數(shù)量。細胞至于體積分數(shù)5% CO2、37 ℃、濕度75%的培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)。72 h更換生長培養(yǎng)基(45 mL α-MEM+5 mL FBS+0.5 mL P/S)，之后每3 d更換1次培養(yǎng)基，待細胞80%～90%融合后傳代，用胰蛋白酶消化細胞至大部分細胞重新懸浮，再加入培養(yǎng)基終止胰蛋白酶消化作用，1 000 r/min離心5 min；棄上清，用培養(yǎng)基重懸細胞后移至新的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。傳至第3代后進行成骨誘導。

1.2主要儀器、試劑及藥物

研究型正置熒光生物顯微鏡(OLYPUS公司，日本)、T100梯度PCR儀、CFX96實時熒光定量PCR儀(Bio-Rad，美國)，全波長酶標儀(Thermo，美國)、電泳儀(BIO-RAD，美國)、垂直板電泳裝置(BIO-RAD，美國)、Tanon-2500R型全自動數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad，美國)等。

α-MEM培養(yǎng)基(Gibco公司，美國)，胎牛血清(FBS；Gibco公司，美國)，胰蛋白酶(Gibco公司，美國)，C57BL/6小鼠BMSCs成骨誘導分化培養(yǎng)基[α-MEM基礎(chǔ)上含10% FBS+1% Penicillin-Streptomycin雙抗+50 μg/mL抗壞血酸+10 mmol/L β-甘油磷酸鈉；賽業(yè)(蘇州)生物科技有限公司，中國]，堿性磷酸酶(ALP)活性檢測試劑盒(Roche公司，瑞士)，茜素紅S(Roche公司，瑞士)，Trizol (Invitrogen公司，美國)，RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTM RT Master Mix、熒光定量SYBR? Premix ExTaq TMⅡ試劑盒(TAKARA，日本)，Runx2、OCN、Smad1、Smad5引物(Life公司，美國)，抗-Smad1/5/8抗體(1∶500；CST公司，美國)，抗磷酸化Smad1/5(pSmad1/5)抗體(1∶500；CST公司，美國)；醋酸地塞米松片(Sigma公司，美國)；ASD(Sigma公司，美國)等。

1.3實驗方法

1.3.1藥物干預(yù)：細胞分別用成骨誘導培養(yǎng)基(OBI)、OBI+DEXA(0.1 μmol/L)、OBI+DEXA(0.1 μmol/L)+ASD(10 μmol/L)干預(yù)，分別進行堿性磷酸酶(ALP)活性測定，茜素紅染色檢測成骨早期礦化情況；定量實時熒光PCR(qRT-PCR)檢測成骨因子骨鈣素(osteocalcin, OCN)、Runx2以及Smad信號通路Smad1、Smad5的表達，Western blot檢測Smad信號通路Smad1/5磷酸化水平和Smad1/5/8總蛋白水平。

1.3.2ALP活性檢測：藥物干預(yù)5 d后收集細胞培養(yǎng)液上清，測定ALP活性，具體步驟方法參照試劑盒操作。

1.3.3茜素紅染色檢測成骨礦化情況：藥物干預(yù)14 d后取出1塊12孔板，吸去培養(yǎng)基，PBS(1×)清洗2遍，加入95%戊二醛溶液固定，4°過夜，40 mmol/L茜素紅染色15 min，水洗3次，PBS(1×)洗滌15 min后，拍照洗脫茜素紅測OD值。

圖2 不同干預(yù)誘導成骨礦化情況Fig.2 Osteogenic mineralization in different treatments

1.3.4qRT-PCR檢測續(xù)斷皂苷對DEXA環(huán)境下成骨因子mRNA表達的影響：藥物干預(yù)5 d后，用異硫氰酸胍(Trizol)法提取細胞總RNA，RNA酶消化并反轉(zhuǎn)錄，qRT-PCR反應(yīng)引物：Runx2：GACCAGTC TTACCCCTCCTA和GDEXAAGTGTCATCATCTGAAA；OCN：CTCTCTCTDEXATCACTCTDEXAT和GACTGA GDEXATCCAAGGTAG；Smad1：DEXATTCGTGAA GGGTTGGGG和CGGATGAAATAGGATTGTGGGG；Smad5：TTGTTCAGAGTAGGAACTDEXAAAC和GAADEXATGADEXAAAACTCCTGAT。反應(yīng)條件：95 ℃，3 min變性；95 ℃，30 s；60 ℃，40 s，共40個循環(huán)。

1.3.5Western blot檢測ASD對DEXA環(huán)境下Smad信號蛋白表達的影響：藥物干預(yù)14 d后，加入RIPA細胞裂解液300 μL，冰上裂解30 min，12 000 r/min離心10 min，檢測蛋白濃度，用等量2-上樣緩沖液(2-SDS-PAGE Sample/Loading Buffer)混勻煮沸10 min，提取20 μg的蛋白行SDS-PAGE電泳，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，室溫下封閉1 h，一抗室溫孵育2 h后，TBST洗膜3次(10 min/次)，二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜3次(10 min/次)，DAB試劑盒顯色曝光拍照。

1.4統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1ALP活性

ALP活性見圖1。DEXA環(huán)境下，小鼠BMSCs ALP活性明顯降低(P<0.001)，ASD明顯增加了DEXA干預(yù)下BMSCs的成骨活性(P<0.01)。

圖1 不同干預(yù)BMSCs ALP活性Fig.1 ALP activity of BMSCs treated with different methods

2.2茜素紅染色

茜素紅染色見圖2。與單純成骨誘導比較，BMSCs在DEXA干預(yù)下，成骨礦化結(jié)節(jié)明顯減少；與DEXA干預(yù)比較，DEXA+ASD干預(yù)明顯增加了礦化。

2.3不同干預(yù)下Runx2、OCN、Smad1、Smad5 mRNA表達水平

圖3 mRNA相對表達水平Fig.3 Relative expression levels of mRNAs

不同干預(yù)下Runx2、OCN、Smad1、Smad5 mRNA表達水平見圖3。與OBI比較，OBI + DEXA干預(yù)組Runx2、OCN、Smad1和Smad5 mRNA表達均明顯下調(diào)(P<0.01)，OBI + DEXA+ASD干預(yù)組Runx2、OCN、Smad1和Smad5 mRNA表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；OBI +DEXA+ASD干預(yù)組較OBI +DEXA干預(yù)組Runx2、OCN、Smad1和Smad5 mRNA表達明顯上調(diào)(P<0.01和P<0.05)。

2.4不同干預(yù)下Smad1/5蛋白磷酸化水平

不同干預(yù)下Smad1/5蛋白磷酸化水平見圖4。與OBI組比較，OBI + DEXA干預(yù)、OBI + DEXA + ASD干預(yù)小鼠BMSCs后Smad1/5/8總蛋白表達無明顯變化；OBI + DEXA干預(yù)后磷酸化Smad1/5(pSmad1/5)蛋白表達明顯降低，ASD可增加DEXA環(huán)境下Smad1/5蛋白的磷酸化水平。

圖4 Smad1/5/8和pSmad1/5蛋白表達情況Fig.4 Expression of Smad1/5/8 and pSmad1/5 proteins

3 討論

糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松(glucocorticoid-induced osteoporosis, GIOP)是目前最常見的繼發(fā)性骨質(zhì)疏松[1]。其發(fā)病機制仍未完全清楚，近期發(fā)現(xiàn)DEXA可增加破骨細胞活性，抑制成骨細胞增殖，誘導成骨細胞和骨細胞凋亡，降低骨量[6]。有研究也發(fā)現(xiàn)DEXA可抑制大鼠BMSC增殖和成骨分化[7]，這與本研究的結(jié)果一致。需要指出，雖然低劑量(或濃度)DEXA可促進成骨分化——在含維生素C(或稱抗壞血酸)、β-甘油磷酸鹽的成骨誘導劑基礎(chǔ)上添加微量DEXA是誘導成骨分化常用的方法，亦有眾多研究在誘導成骨分化時未添加DEXA而只添加維生素C、β-甘油磷酸鹽[8-10]，本研究中誘導成骨的方法正是參照這些研究。

木通皂苷D(akebia saponin D，ASD)又稱川續(xù)斷皂苷VI，是川續(xù)斷的主要活性成分，具有治療抗骨質(zhì)疏松、糖尿病、高脂血癥等藥理作用[11]，具有很高的研究和開發(fā)價值。雖然已有研究發(fā)現(xiàn)ASD可促進BMSCs成骨分化[4, 12-13]，但相關(guān)研究仍較少，且ASD對DEXA環(huán)境下BMSCs成骨分化的影響及其機制仍未見報道。ALP主要分布在細胞膜，是膜結(jié)合胞外酶[14]，協(xié)助轉(zhuǎn)運鈣，參與細胞成熟、鈣化[15], 是成骨細胞分化早期標志物[16]。本研究中，ASD干預(yù)DEXA環(huán)境下小鼠BMSCs，可明顯增強ALP活性，證實了ASD的促成骨分化的作用，與上述既往研究結(jié)果類似。

OCN是成骨細胞分化中期的重要標志物[17]，也是調(diào)節(jié)骨質(zhì)鈣化的重要因子，參與骨組織的正常礦化[18]。Runx2是BMSCs向成骨方向分化的首要決定因子，是成骨細胞分化早期主要骨基質(zhì)基因表達的啟動子[19]。我們的研究結(jié)果顯示，ASD上調(diào)了被DEXA抑制的OCN和Runx2表達，進一步證實了ASD促進成骨分化，提示其機制可能與靶向調(diào)控OCN和Runx2的表達有關(guān)。

BMP/Smad信號通路是調(diào)控成骨的重要通路。BMP受體介導BMP/Smad信號通路轉(zhuǎn)導：磷酸化Smad1、Smad5和Smad8，使其形成復(fù)合物并與Smad4結(jié)合，轉(zhuǎn)移入核，與其他轉(zhuǎn)錄因子如Runx2相互作用，啟動成骨相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[20]。本研究中，DEXA干預(yù)下，Smad1、Smad5 mRNA表達均明顯下調(diào)，而ASD可上調(diào)被DEXA抑制的Smad1、Smad5表達，提示ASD可靶向上調(diào)BMP/Smad信號通路中Smad1、Smad5元件表達；另外，DEXA或DEXA+ASD干預(yù)，Smad1/5/8總蛋白表達均無明顯變化，而DEXA降低了pSmad1/5蛋白水平，ASD增加了被DEXA抑制的pSmad1/5表達，證實ASD可激活被DEXA抑制的BMP/Smad信號通路。

綜上所述，ASD可促進DEXA環(huán)境下小鼠BMSCs成骨分化，其機制可能與激活BMP/Smad信號通路有關(guān)。