王慧娟，吳正奇，黃夢萍，葉文祥，萬端極，*

（1.湖北工業(yè)大學土木建筑與環(huán)境學院，湖北武漢430068；2.湖北工業(yè)大學生物工程與食品學院，湖北武漢430068）

牡丹屬芍藥科落葉灌木，也是中國著名的觀賞華卉[1]。牡丹籽含油率在24%～37.8%左右[2]，其中不飽和脂肪酸含量超過90%，亞麻酸約占到45%[3-4]，而不飽和脂肪酸可降低冠心病風險[5]。牡丹籽油相較亞麻籽油，γ-生育酚、角鯊烯、甾醇含量更高[6]，而它們均具有良好的抗氧化作用。研究表明，牡丹籽油具有良好的抗氧化[7]、降血脂[8]、抗糖尿病[9]、防曬作用[10]，無毒食用安全[11]，高溫煎炸10次仍符合國家植物油衛(wèi)生標準[12]。據(jù)不完全統(tǒng)計，我國油用牡丹種植面積約有2萬hm2，牡丹籽油加工企業(yè)9個[13]，其中，菏澤堯舜牡丹生物科技有限公司采用超臨界CO2萃取技術(shù)，已建成國內(nèi)最大的牡丹籽油生產(chǎn)線[14]。

目前，工業(yè)中提取植物油的方法主要為壓榨法和溶劑法。水酶法作為新興的提油方法，因其提油率高、提取條件溫和、沒有引入其他溶劑、提油的同時可以得到水解蛋白，近年來受到頗多關(guān)注?，F(xiàn)階段牡丹籽油的水酶法工藝存在的主要困難是形成較厚的乳化層，限制了油脂的游離。Rosenthal等[15]指出乳化層的破乳取油為水酶法的一大技術(shù)難點。本試驗采用乙醇預(yù)處理水酶法提取牡丹籽油，利用乙醇的破乳作用，研究乙醇預(yù)處理階段中料液比、乙醇濃度、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間對游離油提取率的影響，從而確定了乙醇預(yù)處理的最佳提油工藝條件，以期為牡丹籽油的工業(yè)化應(yīng)用提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牡丹籽仁：產(chǎn)自山西；堿性蛋白酶（20萬U/g）：龐博生物工程有限公司；其它試劑均為分析純。

HH-601電熱恒溫水浴鍋：上海偉業(yè)儀器廠；320-S pH計：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；101A-1型電熱鼓風干燥箱：南京恒星實驗設(shè)備有限公司；EX223ZH電子精密天平：奧豪斯國際貿(mào)易（上海）有限公司；DK-98-Ⅱ電子萬用爐、SX-10-12型箱式電阻爐控制箱、FW177中草藥粉碎機：天津泰斯特儀器有限公司；K1100F全自動凱式定氮儀、SH420F石墨消解儀：武漢海能科學儀器有限公司；TDL-5-A離心機：上海安亭科學儀器廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 提取方法及操作要點

牡丹籽仁→篩選→干燥→粉碎→過篩（40目）→乙醇預(yù)處理→離心→渣相→加水堿提→酶解→離心→牡丹籽游離油

選用新鮮牡丹籽仁，剔除未完全去殼部分，余下部分在65℃的烘箱中干燥至恒重，然后用中草藥粉碎機粉碎（注意防止粉碎機溫度過高造成油脂氧化）后過40目篩，準確稱取牡丹籽粉與一定濃度的乙醇溶液按一定的料液比混合，在一定的溫度下反應(yīng)一定時間后離心（3 000 r/min），得上清液和渣相；上清液即乙醇提取液，渣相按1∶3（g/mL）的料液比加水混勻，在pH 10.0、溫度為35℃下堿提1 h，然后將混合液的溫度和pH值調(diào)節(jié)為堿性蛋白酶最適條件，加入15%的酶量（酶/底物·干基計）酶解5 h后離心（3 000 r/min），取上層清油即為牡丹籽游離油，測定游離油提取率。

1.2.2 單因素試驗

按照1.2.1的工藝，研究乙醇溶液料液比、乙醇濃度、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間對游離油提取率的影響。

1.2.2.1 料液比對游離油提取率的影響

牡丹籽粉與70%的乙醇溶液分別按1∶6、1∶7、1∶8、1 ∶9、1 ∶10（g/mL）的料液比混合，在 25 ℃下反應(yīng)5 h后離心，所得渣相按照1.2.1的工藝條件堿提、酶解、離心，取上層清油稱重，計算游離油提取率。

1.2.2.2 乙醇濃度對游離油提取率的影響

牡丹籽粉分別與70%、75%、80%、85%、90%的乙醇溶液按1∶8（g/mL）的料液比混合，在25℃下反應(yīng)5 h后離心，所得渣相按照1.2.1的工藝條件堿提、酶解、離心，取上層清油稱重，計算游離油提取率。

1.2.2.3 反應(yīng)溫度對游離油提取率的影響

牡丹籽粉與80%的乙醇溶液按1∶8（g/mL）的料液比混合，混合液分別在 15、25、35、45、55℃下反應(yīng)5 h后離心，所得渣相按照1.2.1的工藝條件堿提、酶解、離心，取上層清油稱重，計算游離油提取率。

1.2.2.4 反應(yīng)時間對游離油提取率的影響

牡丹籽粉與80%的乙醇溶液按1∶8（g/mL）的料液比混合，混合液在 35 ℃下分別反應(yīng) 4、5、6、7、8 h 后離心，所得渣相按照1.2.1的工藝條件堿提、酶解、離心后，取上層清油稱重，計算游離油提取率。

1.2.3 正交試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，對乙醇預(yù)處理階段中的料液比、乙醇濃度、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間4個因素進行正交試驗。每個因素選取3個顯著水平，以游離油提取率為指標，進行L9（34）乙醇預(yù)處理條件的正交試驗，因素水平表見表1。

表1 乙醇預(yù)處理條件的正交試驗設(shè)計表Table 1 Orthogonal experiment design of ethanol pretreatment conditions

1.3 分析方法

1.3.1 牡丹籽主要成分的分析

水分按照GB 5009.3-2016《食品安全國家標準食品中水分的測定》執(zhí)行；脂肪按照GB 5009.6-2016《食品安全國家標準食品中脂肪的測定》執(zhí)行；蛋白質(zhì)按照GB 5009.5-2016《食品安全國家標準食品中蛋白質(zhì)的測定》凱氏定氮法執(zhí)行；灰分按照GB 5009.4-2016《食品安全國家標準食品中灰分的測定》執(zhí)行。

1.3.2 牡丹籽游離油提取率的計算

式中：m為游離油質(zhì)量，g；M為干燥牡丹籽質(zhì)量，g；α為牡丹籽中脂肪的質(zhì)量分數(shù)，%。

2 結(jié)果與分析

2.1 牡丹籽仁主要成分及含量

牡丹籽仁主要成分及含量見表2。

表2 牡丹籽仁主要成分及含量Table 2 Main components and content of peony seed kernel %

由表2可知，牡丹籽仁富含脂肪和蛋白質(zhì)，而在水酶法工藝中蛋白質(zhì)的乳化性會束縛油脂的游離。

2.2 單因素試驗

水酶法提取牡丹籽油，由于在水相體系中反應(yīng)，牡丹籽自身磷脂、蛋白質(zhì)、脂肪酸、小分子糖等物質(zhì)會影響油脂的游離。其中，磷脂和蛋白質(zhì)是良好的乳化劑，脂肪酸在堿性環(huán)境下生成表面活性劑脂肪酸鈉，而大量小分子糖的存在也會增加蛋白質(zhì)的乳化性[16]。并且乙醇作為一種毒性較小、價格低廉、廣泛應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)中的有機溶劑，一定濃度的乙醇溶液既可以使牡丹籽粉中磷脂、脂肪酸、小分子糖等物質(zhì)溶出，又可以通過降低牡丹籽蛋白質(zhì)的溶解性，防止由于較長時間的反應(yīng)而形成的頑固乳化層。此外由于油脂不溶于極性溶劑乙醇，因而采用乙醇預(yù)處理水酶法提取牡丹籽油是對牡丹籽油沒有損失的。

2.2.1 料液比對游離油提取率的影響

料液比對游離油提取率的影響見圖1。

圖1 料液比對游離油提取率的影響Fig.1 The influence of solid-liquid ratio on extraction rate of free oil

由圖 1可知，料液比在 1∶6（g/mL）～1∶8（g/mL）間，隨著料液比的增大游離油提取率增加很快，當料液比超過1∶8（g/mL）時，提取率變化不大。分析原因可能為，一定范圍內(nèi)增加溶劑用量，使得牡丹籽粉內(nèi)磷脂、脂肪酸、小分子糖等物質(zhì)溶出增加，從而致使后續(xù)渣相堿提、酶解液內(nèi)起乳化作用的物質(zhì)減少，利于油脂游離，但當料液比達到一定程度時，牡丹籽粉中的磷脂、脂肪酸、小分子糖在乙醇中的溶解已比較充分，繼續(xù)增大料液比對游離油提取率沒有改善，同時考慮成本，選擇最佳料液比為1∶8（g/mL）。

2.2.2 乙醇濃度對游離油提取率的影響

乙醇濃度對游離油提取率的影響見圖2。

圖2 乙醇濃度對游離油提取率的影響Fig.2 The influence of ethanol concentration on extraction rate of free oil

由圖2可知，游離油提取率隨乙醇濃度的增加逐漸增加，當乙醇濃度達到80%時游離油提取率最高。分析原因可能為乙醇濃度越大，牡丹籽粉中磷脂、小分子糖、脂肪酸等物質(zhì)的溶出越充分，那么這些物質(zhì)殘留在渣相中的量就越少，利于渣相在堿提酶解過程中油脂的游離。但過高的乙醇濃度，游離油提取率反而降低，這是因為水對物料的溶脹作用，該作用能增大物料與溶劑的接觸面積[17]，較高的乙醇濃度含水量較少，牡丹籽粉溶脹不充分，從而使得磷脂、小分子糖、脂肪酸的溶出不充分，反而較多的殘留在渣相，最終導致游離油提取率降低。因此，最佳乙醇濃度為80%。

2.2.3 反應(yīng)溫度對游離油提取率的影響

反應(yīng)溫度對游離油提取率的影響見圖3。

由圖3可知，游離油提取率隨乙醇溶液溫度升高，呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，在35℃時提取率最高。分析原因可能為，溫度升高磷脂、小分子糖、脂肪酸在乙醇溶液中的溶解增加，但當溫度超過35℃，由于卵磷脂在乙醇中的溶解過程是放熱反應(yīng)，溫度升高卵磷脂溶解度降低[18]，因而渣相殘留的卵磷脂增多，導致在堿提酶解階段較多的油脂被束縛無法游離。因此最佳溫度為35℃。

圖3 反應(yīng)溫度對游離油提取率的影響Fig.3 The influence of temperature on extraction rate of free oil

2.2.4 反應(yīng)時間對游離油提取率的影響

反應(yīng)時間對游離油提取率的影響見圖4。

圖4 反應(yīng)時間對游離油提取率的影響Fig.4 The influence of time on extraction rate of free oil

由圖4可知，隨著反應(yīng)時間的延長，游離油提取率越來越大，超過7 h后提取率增長不顯著。分析原因可能為，維持提取過程進行的推動力是有效成分的濃度差，提取開始時，固液濃度差很大，擴散推動力大，磷脂、小分子糖、脂肪酸的溶出逐漸增加，這些物質(zhì)在渣相中的含量逐漸越少，從而促使游離油提取率增加；但是隨著時間的延長，渣相和乙醇提取液兩相中磷脂、小分子糖、脂肪酸等物質(zhì)的濃度達到或接近平衡，游離油提取率也基本維持穩(wěn)定。因此，最佳反應(yīng)時間為7 h。

2.3 乙醇預(yù)處理條件的正交試驗

根據(jù)單因素試驗情況，以游離油提取率為指標，對主要影響因素乙醇溶液料液比（A）、乙醇濃度（B）、反應(yīng)溫度（C）、反應(yīng)時間（D）4個因素每個因素選取3個顯著水平進行L9（34）的正交試驗，試驗結(jié)果見表3。

由表3的極差分析可知，在乙醇預(yù)處理階段中各因素對牡丹籽游離油提取率的影響依次為乙醇濃度＞反應(yīng)溫度＞料液比＞反應(yīng)時間，最佳提取條件為A2B2C2D2，即料液比為 1 ∶8（g/mL）、乙醇濃度為 80%、乙醇溶液溫度為35℃、處理時間7 h。

表3 正交試驗結(jié)果Table 3 Orthogonal experiment results

2.4 優(yōu)化工藝重復性考察

為驗證水酶法提取牡丹籽油的最佳乙醇預(yù)處理工藝條件，準確稱取50、100、200 g的牡丹籽粉3份分別與80%乙醇溶液按1∶8（g/mL）的料液比混合，在35℃下反應(yīng)7 h后離心，所得渣相按1.2.1的具體工藝堿提、酶解、離心。3份牡丹籽樣品的游離油提取率依次為90.29%、90.34%、90.31%，平均值為90.31%。經(jīng)測定所制備的牡丹籽油中乙醇殘留符合牡丹籽油行業(yè)標準，即小于10 mg/kg。因此，該提取條件合理、重復性好。

3 結(jié)論

本研究采用乙醇預(yù)處理水酶法提取牡丹籽油，在本課題前期研究所得牡丹籽最佳堿提、酶解條件的基礎(chǔ)上，通過單因素試驗和正交試驗優(yōu)化了乙醇預(yù)處理的工藝條件，所得最佳提取牡丹籽油工藝條件為：乙醇溶液料液比為1∶8（g/mL）、濃度為80%、反應(yīng)溫度為35℃、反應(yīng)時間為7 h。在此條件下，游離油提取率高達90.31%，且該工藝重復性較好，溶劑殘留符合牡丹籽油行業(yè)標準，與傳統(tǒng)的水酶法工藝相比，此方法游離油提取率得到了較大的提升。值得注意的是，申少斐[19]等發(fā)現(xiàn)牡丹籽仁中低聚芪類物質(zhì)含量較高，劉普[20]等發(fā)現(xiàn)在油用牡丹脫殼餅粕中單萜苷類物質(zhì)的含量遠大于其在牡丹籽殼中的含量，其中，芍藥苷的含量最高。同時，現(xiàn)已有研究使用70%左右的乙醇溶液從牡丹籽中提取低聚芪類[19]和芍藥苷[21]，并獲得了較高的提取率。因此，采用乙醇預(yù)處理水酶法提取牡丹籽油工藝，通過不斷地試驗，有望實現(xiàn)可以同時得到活性物質(zhì)、油脂和水解蛋白，從而進一步實現(xiàn)牡丹籽的綜合開發(fā)。