張百剛，梁海榮，馮再平，鹿琪坤，李金亮

(蘭州理工大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730050)

烏龜(Chinemysreevesii)是我國的傳統(tǒng)物種，故國外有關(guān)研究很少，楊文鴿等[1]研究表明，烏龜?shù)乃?、總糖、總灰分、蛋白質(zhì)、氨基酸以及脂肪酸等營養(yǎng)成分含量極高。龜甲(Carapax et Plustrum Testudinis)為龜科動(dòng)物烏龜?shù)谋臣准案辜譡2]。龜甲具有豐富的活性物質(zhì)，如多酚類物質(zhì)、礦物質(zhì)元素、甾體類、羥脯氨酸、脂肪酸等[3]。龜甲有滋陰潛陽、益腎強(qiáng)骨、養(yǎng)血補(bǔ)心的藥理功效，用于治療陰虛潮熱、骨蒸盜汗、頭暈?zāi)垦！⑻擄L(fēng)內(nèi)動(dòng)、筋骨痿軟和心虛健忘等癥狀[2]。我國食用烏龜者大多棄甲而食，造成了極大的浪費(fèi)且污染環(huán)境。因此，本研究以廢棄龜甲為原料，提取其膠原蛋白，為龜甲的綜合利用提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

龜甲收集于農(nóng)貿(mào)市場。試劑：胃蛋白酶、乙酸乙酯、硫酸鉀、硫酸銅、濃硫酸、85%磷酸、均為分析純。

FA2104型電子分析天平，美國UniVersal低溫高速離心機(jī)，HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋，UV-9200型紫外可見光分光光度計(jì)，日本島津真空冷凍干燥機(jī)，真空干燥箱，凱氏定氮儀。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程 工藝流程：龜甲→洗凈→烘干→粉碎→烘干→脫脂→酶解→離心→冷凍干燥→稱重→測蛋白含量[4]。

操作要點(diǎn)：使用乙酸乙酯脫脂，胃蛋白酶酶解，離心條件為8000 r/min下離心15 min、棄沉淀，冷凍干燥48 h,并測定蛋白質(zhì)含量，按照公式計(jì)算蛋白質(zhì)的提取率。

蛋白提取率/%=[凍干膠原蛋白總含量(g/g)×凍干粗品質(zhì)量(g)×100%]/初始龜甲粉質(zhì)量(g)

1.2.2 試驗(yàn)內(nèi)容

1.2.2.1 脂肪含量的測定 索氏抽提法脫脂：參考國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.6─2016。

1.2.2.2 蛋白質(zhì)含量的測定 (1)凱氏定氮法：參考國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.5─2016；(2)考馬斯亮藍(lán)法：具體步驟參考文獻(xiàn)[5],繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線參照文獻(xiàn)[6],代入下面公式得到樣品蛋白質(zhì)含量。

樣品蛋白質(zhì)含量/(g/g)=樣品蛋白質(zhì)濃度(mg/mL)×提取液的總體積(mL)/樣品干重(mg)

1.2.2.3 脫脂時(shí)間確定 準(zhǔn)確稱取10 g龜甲粉加入100 mL的錐形瓶中，再加入50 mL的乙酸乙酯，搖勻，在通風(fēng)處進(jìn)行，分別放置3、4、5、6、7、8 h，測定龜甲粉中的脂肪含量，并記錄數(shù)據(jù)。

1.2.2.4 單因素試驗(yàn) (1)pH值對膠原蛋白初步提取的影響：準(zhǔn)確稱取脫脂后的龜甲粉1 g若干份，在酶用量4%、底物濃度6%、酶解溫度37 ℃、酶解時(shí)間4 h的條件下，pH值分別為1.0、1.5、2.0、2.5的條件下處理龜甲，在8000 r/min下離心15 min，棄沉淀，用凱氏定氮法測定總氮含量，乘以蛋白系數(shù)計(jì)算膠原蛋白的含量，探討了不同pH值對膠原蛋白初步提取的影響。

(2)酶用量對膠原蛋白初步提取的影響：準(zhǔn)確稱取脫脂后的龜甲粉1 g若干份，分別選用酶用量為3%、4%、5%、6%的條件下處理龜甲，其余條件同上，研究酶用量對膠原蛋白提取率的影響。

(3)溫度對膠原蛋白初步提取的影響：準(zhǔn)確稱取脫脂后的龜甲粉1 g若干份，分別選用酶解溫度為32、37、42、47 ℃的條件下處理龜甲，其余條件同上，研究酶解溫度對膠原蛋白提取率的影響。

(4)時(shí)間對膠原蛋白初步提取的影響：準(zhǔn)確稱取脫脂后的龜甲粉1 g若干份，分別選用酶解時(shí)間為3、4、5、6 h的條件下處理龜甲，其余條件同上，研究酶解時(shí)間對膠原蛋白提取率的影響。

1.2.2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 運(yùn)用Box-Behnken Design設(shè)計(jì)原理，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，取酶用量(A)、酶解溫度(B)、酶解時(shí)間(C)等3個(gè)因素，以膠原蛋白的含量為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3因素3水平的中心組合試驗(yàn)，試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表2。

1.2.2.6 數(shù)據(jù)分析 每個(gè)樣品做3個(gè)平行，用Excel 2007軟件將數(shù)據(jù)處理并求出平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差。用Design expert 10軟件進(jìn)行響應(yīng)面的數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 脫脂時(shí)間的確定

未脫脂之前，測得龜甲粉中的可溶性物質(zhì)含量大約為45.63%。由圖1可知，隨著脫脂時(shí)間的變長，龜甲中的脂肪含量越來越少，脫脂時(shí)間達(dá)到6 h，龜甲中的脂肪含量最低，再增加脫脂時(shí)間，則龜甲中的脂肪含量幾乎不變，且穩(wěn)定在1.40%左右。根據(jù)資料顯示，脂肪的存在，會(huì)干擾膠原蛋白的提取，為了有效地進(jìn)行試驗(yàn)，最佳脫脂時(shí)間確定為6 h。

圖1 龜甲中脂肪含量的變化

圖2 酶解pH值對膠原蛋白含量的影響

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 酶解pH值對膠原蛋白提取量的影響 由圖2可知，隨著酶解pH值增大，膠原蛋白的含量也在逐漸增大，當(dāng)酶解pH值增大到1.5時(shí)，此時(shí)的膠原蛋白含量出現(xiàn)最高值，當(dāng)再增大其酶解pH值時(shí)，膠原蛋白含量出現(xiàn)下降的趨勢。pH值過高過低都會(huì)影響酶活性，故將pH值1.5確定為胃蛋白酶的最佳酶解時(shí)間。

2.2.2 酶用量對龜甲膠原蛋白提取量的影響 由圖3可知，隨著酶用量的升高，膠原蛋白的含量也在慢慢增大，當(dāng)酶用量增大到4%時(shí)，此時(shí)的膠原蛋白含量出現(xiàn)最高值，當(dāng)再增大其酶用量值時(shí)，其膠原蛋白含量呈現(xiàn)先不變再快速下降的趨勢，故將酶用量4%確定為胃蛋白酶的最佳酶用量。

其原因是酶作為一種生物催化劑，對底物的催化能力存在一定的飽和度，剛開始是隨著酶與底物的結(jié)合是趨于飽和的，因此膠原蛋白的含量會(huì)增加，當(dāng)酶用量達(dá)到一定飽和值時(shí)，這時(shí)過多的酶會(huì)將龜甲中的膠原蛋白溶解，反而使膠原蛋白含量下降[7]。

圖3 酶用量對膠原蛋白含量的影響

圖4 酶解溫度對膠原蛋白含量的影響

2.2.3 酶解溫度對龜甲膠原蛋白提取量的影響 由圖4可知，隨著酶解溫度的升高，膠原蛋白的含量也在逐漸增大，當(dāng)酶解溫度升高到37 ℃時(shí)，此時(shí)的膠原蛋白含量出現(xiàn)最高值，當(dāng)再升高酶解溫度時(shí)，其膠原蛋白含量呈現(xiàn)出緩慢下降的趨勢，故最佳酶解溫度為37 ℃?？赡芤?yàn)槊甘怯苫罴?xì)胞產(chǎn)生的一種特殊蛋白質(zhì)，具有高效的催化作用，對底物的高效催化能力需要在一定的條件下，如最適溫度、最適pH值等。

2.2.4 酶解時(shí)間對龜甲膠原蛋白提取量的影響 由圖5可知，隨著酶解時(shí)間的延長，膠原蛋白的含量也在逐漸增大，當(dāng)酶解時(shí)間接近5 h時(shí)，膠原蛋白含量出現(xiàn)最佳值，當(dāng)酶解時(shí)間再增大時(shí)，其膠原蛋白含量出現(xiàn)急速下降的趨勢，故最佳酶解時(shí)間為5 h。酶解時(shí)間過短，則底物與酶的接觸時(shí)間不夠，使得酶解不充分；酶解時(shí)間過長，則酶有可能將龜甲中的膠原蛋白溶解。

2.3 響應(yīng)面分析

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果 試驗(yàn)中心組和設(shè)計(jì)水平如表1所示，試驗(yàn)結(jié)果與方案見表2，利用Design expert 10軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到回歸方程[8-9]：

CC(g/g)=0.12-0.010375A-0.013375B+0.003C-0.01225AB-0.0205AC-1.23759×10-19BC-0.013375A2-0.004875B2-0.012625C2

圖5 酶解時(shí)間對膠原蛋白初步提取的影響

表1 Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)水平

表2 試驗(yàn)方案與結(jié)果

2.3.2 方差分析 整理數(shù)據(jù)得該擬合的二次回歸模型及各項(xiàng)方差分析結(jié)果如表3所示，一次項(xiàng)中A的回歸系數(shù)顯著，說明酶用量對提取膠原蛋白含量的影響顯著，一次項(xiàng)中B的回歸系數(shù)極顯著，說明酶解溫度對提取蛋白含量的影響是極顯著；交互項(xiàng)AB的偏回歸系數(shù)顯著，說明酶用量和酶解溫度對提取蛋白含量有顯著的影響，交互項(xiàng)AC的偏回歸系數(shù)極顯著，說明酶用量和酶解時(shí)間對提取蛋白含量有極顯著的影響；2個(gè)二次項(xiàng)A2、C2的偏回歸系數(shù)均達(dá)到顯著水平[9]?；貧w模型是極顯著的(P=0.0091<0.05),模型R2=0.5050，說明模型擬合程度一般，能夠反映數(shù)據(jù)50.50%的有效性，失擬項(xiàng)F值為0.40(P=0.7596>0.05)，表明失擬項(xiàng)不顯著，試驗(yàn)誤差較小，用此模型對胃蛋白酶酶解提取龜甲膠原蛋白工藝優(yōu)化的預(yù)測是可行的。遺憾的是，此模型的決定系數(shù)R2為0.5050，模型的調(diào)整確定系數(shù)R2為0.7656，它們之間相差0.2606，超過0.2。這表明此模型或數(shù)據(jù)可能有一個(gè)大的塊效應(yīng)問題。需要考慮的是模型還原、響應(yīng)變換、異常值等，因此在以后的試驗(yàn)中需要有所改進(jìn)。

表3 回歸方程方差分析

注：*、**分別表示在0.05、0.01水平上的差異顯著性。下同。

2.3.3 回歸模型的優(yōu)化 由于交互項(xiàng)中BC、二次項(xiàng)B2對提取蛋白含量沒有顯著的影響，因此采用手動(dòng)優(yōu)化法對回歸模型再一次進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化結(jié)果為FC(15.93)>FB(14.14)>FA(9.59)，因此各因素對于龜甲中提取蛋白的影響大小順序依次是：酶解時(shí)間(C)>酶解時(shí)間(B)>酶用量(A)。

2.3.4 響應(yīng)面曲面分析 根據(jù)回歸方程做出響應(yīng)面考察擬合響應(yīng)曲面的形狀，可直觀地描述各個(gè)因素之間的交互項(xiàng)的相互影響。等高線形狀反映各個(gè)交互項(xiàng)之間作用的強(qiáng)弱，若為圓形則表示各因素的交互作用效果不顯著，若為橢圓形則表示顯著。如圖6、圖7所示的響應(yīng)面和等高線可以看出各因素之間的交互作用，酶用量和酶解溫度的交互作用、酶用量和酶解時(shí)間的交互作用的等高線形狀均為橢圓形，因此酶用量和酶解溫度的交互作用、酶用量和酶解時(shí)間的交互作用均顯著。

如圖6所示，隨著酶用量A和酶解溫度B的增大，蛋白含量先上升，達(dá)到最高點(diǎn)后，又逐漸下降，說明酶用量A和酶解溫度B只有趨于某一中間值時(shí)，能使提取的蛋白含量達(dá)到最大值。

如圖7所示，隨著酶用量A和酶解時(shí)間B的增加，蛋白含量先快速上升，達(dá)到最高點(diǎn)后，一邊明顯下降，一邊有上升的趨勢，可能是試驗(yàn)操作的誤差帶來的結(jié)果或者最佳范圍未在該區(qū)域。

圖6 Y=(A.B)的等高圖和響應(yīng)面圖

2.3.5 試驗(yàn)驗(yàn)證 對試驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行分析可得胃蛋白酶解龜甲提取蛋白的最佳理論工藝條件為：酶用量3.945%、酶解溫度38.070 ℃、酶解時(shí)間4.754 h，此條件下的蛋白含量為0.114 g/g；考慮到實(shí)際操作的可行性，對所得工藝修正為酶用量4%，酶解溫度40 ℃，酶解時(shí)間5 h，采用此工藝實(shí)際測得蛋白含量為0.111 g/g，提取率為11.08%，與理論值相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.26%，說明采用響應(yīng)面法得到的工藝參數(shù)可靠，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

圖7 Y=(A.C)的等高圖和響應(yīng)面圖

2.3.6 考馬斯亮藍(lán)法測定膠原蛋白含量

2.3.6.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的試驗(yàn) 標(biāo)準(zhǔn)曲線的試驗(yàn)方案與結(jié)果見圖8。

圖8 牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3.6.2 龜甲膠原蛋白含量測定結(jié)果 如表2所示，考馬斯亮藍(lán)法測定的膠原蛋白含量總體略低于凱氏定氮法測定的蛋白含量，可能因?yàn)榭捡R斯亮藍(lán)G-250與蛋白質(zhì)結(jié)合反應(yīng)十分迅速，2 min左右即達(dá)到平衡，其結(jié)合物室溫下1 h內(nèi)基本保持穩(wěn)定，但在20 min之后線性略有降低，對試驗(yàn)結(jié)果有一定的誤差[10]；考馬斯亮藍(lán)法和凱氏定氮法測定出的蛋白含量總體呈現(xiàn)出一致性，表示考馬斯也可用來測定此膠原蛋白的含量，而且考馬斯測定蛋白質(zhì)相比凱氏定氮法更加節(jié)省時(shí)間和試劑，不足之處是考馬斯亮藍(lán)法沒有凱氏定氮法測定蛋白靈敏、準(zhǔn)確；總的來說，考馬斯亮藍(lán)法和凱氏定氮法都可以用來測定該蛋白的含量。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)在脫脂、單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化龜甲提取膠原蛋白的工藝參數(shù)，并進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，最終確定龜甲膠原蛋白最佳提取工藝為酶用量4%，酶解溫度40 ℃，酶解時(shí)間5 h，pH值1.5，提取的膠原蛋白含量為0.111 g/g。