陳 嘉 盛關(guān)云 侯建華 楊雄武 黃吉輝 楊學(xué)義

(廣西柳州市中醫(yī)醫(yī)院綜合骨科，柳州市 545000，電子郵箱：dadadidi553@126.com)

膝骨關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis，KOA)常表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛和關(guān)節(jié)功能障礙?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為KOA的病理癥狀是因關(guān)節(jié)軟骨損傷所致[1]。良性的應(yīng)力刺激可維護(hù)骨代謝平衡，而這是通過(guò)軟骨表面的力學(xué)信號(hào)感受器來(lái)誘發(fā)力學(xué)信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的[2]。整合素β1所介導(dǎo)的黏著斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)信號(hào)通路是軟骨表面特殊力學(xué)的主要傳導(dǎo)通路之一[3]。FAK作為一種胞質(zhì)非受體蛋白酪氨酸激酶，活化后能與多種下游分子結(jié)合，同時(shí)還能啟動(dòng)絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。在不同的刺激因素下MAPK可被激活而形成不同的轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其中細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)1/2、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)和p38MAPK這3條信號(hào)通路與骨關(guān)節(jié)炎關(guān)系密切。本實(shí)驗(yàn)以KOA兔模型作為研究對(duì)象，觀察刃針干預(yù)對(duì)KOA兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織整合素β1、p38、FAK、JNK等蛋白表達(dá)的影響，并分析針刀干預(yù)的力學(xué)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

1.1.1 儀器：X光機(jī)(上海先威光電科技有限公司，型號(hào)：X-BJI)；HANS 穴位神經(jīng)刺激儀(南京濟(jì)生醫(yī)療科技有限公司,型號(hào)：LH202H)；微型渦旋混合儀(蘇州江東精密儀器有限公司，型號(hào)：WH-3)；蛋白質(zhì)電泳及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)；凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Alpha Innotech公司)；全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀(Tecan 奧地利公司，型號(hào)：Tecan Infinite 200 PRO)；漢章牌一次性無(wú)菌刃針(北京華夏針刀醫(yī)療器械廠，規(guī)格：0.40 mm×40 mm)；華佗牌一次性無(wú)菌電針(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司，規(guī)格：0.25 mm×25 mm)。

1.1.2 試劑：抑制劑PF-562271(美國(guó)塞立克公司，批號(hào):S2890)；整合素β1抗兔單克隆抗體(上海雅吉生物科技有限公司，批號(hào)：S-0342R)；FAK抗兔單克隆抗體(武漢純度生物科技有限公司，批號(hào)：253012)；p38鼠抗兔單克隆抗體(北京百奧萊博科技有限公司，批號(hào)：ABM40362)；JNK鼠抗兔單克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz公司，批號(hào)：BYK-2592R)；ERK1/2抗兔單克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz公司，批號(hào)：GMS41076)；二抗山羊抗小鼠IgG(北京天德悅生物科技有限責(zé)任公司，批號(hào):S001)；蛋白提取試劑盒(碧云天生物有限公司，批號(hào)：C3702)；二喹啉甲酸法蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天生物有限公司，批號(hào)：AR0146)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取6月齡新西蘭白兔63只(購(gòu)自濟(jì)南金豐實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)，均由柳州市中醫(yī)醫(yī)院綜合實(shí)驗(yàn)室喂養(yǎng)，許可證號(hào)：ZKL(桂)20180605。白兔體重2.5～3.0 kg,雌雄不限，普通級(jí)，均為單籠規(guī)律喂養(yǎng)，自由攝食和飲水，自然光線照射，相對(duì)濕度40%～60%，室溫(22±2)℃，定期紫外線消毒。

1.3 模型制備 在63只白兔中，采用隨機(jī)數(shù)字法選取54只白兔的右下肢進(jìn)行造模，采用前交叉韌帶切斷術(shù)建立兔KOA模型。造模前禁食，使用5%的水合氯醛(3 mL/kg)經(jīng)耳緣靜脈注射麻醉白兔，麻醉后仰臥固定于操作臺(tái)上，常規(guī)備皮、消毒，沿膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)做長(zhǎng)縱弧形切口，逐層剖解淺筋膜、肌肉，將髕韌帶移向膝外側(cè)，剖解關(guān)節(jié)囊，屈曲膝關(guān)節(jié)，找出前交叉韌帶并剪斷；徹底止血，將髕骨復(fù)位，采用3-0可吸收縫線閉合關(guān)節(jié)筋膜、關(guān)節(jié)腔，然后采用2-0絲線縫合皮膚。術(shù)后給予每只白兔肌肉注射青霉素20 U/次，預(yù)防感染，2次/d，連續(xù)注射3 d。術(shù)后每日籠外放養(yǎng)2 h，使術(shù)側(cè)膝關(guān)節(jié)主動(dòng)屈伸活動(dòng)，常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)4周。造模前及造模后4周均行X線檢查，了解白兔膝關(guān)節(jié)內(nèi)外側(cè)間隙、關(guān)節(jié)面、關(guān)節(jié)邊緣以及軟骨下骨情況，如X線檢查提示骨質(zhì)疏松，關(guān)節(jié)面不規(guī)則，關(guān)節(jié)間隙狹窄，軟骨下骨質(zhì)硬化以及邊緣唇樣改變，表示建模成功。

1.4 動(dòng)物分組 造模的54只白兔中，2只出現(xiàn)感染，1只出現(xiàn)神經(jīng)壓迫損傷，3只出現(xiàn)骨折，最終共48只造模成功。采用隨機(jī)數(shù)字表法將造模成功的48只白兔隨機(jī)分為模型組、模型抑制組、刃針組、刃針抑制組、電針組、電針抑制組，每組8只。而9只未造模的白兔中，有1只出現(xiàn)足底潰爛，最終納入8只白兔作為空白組。

1.5 干預(yù)方法

1.5.1 空白組：規(guī)律飼養(yǎng)，不予任何干預(yù)。

1.5.2 模型組：造模成功后規(guī)律飼養(yǎng)，不予任何治療。

1.5.3 刃針組：造模成功后1 d，按照《靈樞》“經(jīng)筋理論”闡述的經(jīng)筋分型[4]，在患肢髕周、雙膝眼、膝后處找到條索、筋結(jié)或厚實(shí)感狀的陽(yáng)性反應(yīng)區(qū)，用龍膽紫定位進(jìn)針部位，常規(guī)備皮、消毒。用刃針快速刺入皮膚切面，向結(jié)節(jié)的縱軸方向進(jìn)行上下松解，以刺破深筋膜讓其張力降低為宜。出針時(shí)按壓片刻予以止血；刃針治療后給予梁丘、陽(yáng)陵泉、足三里推拿，以拔伸牽引法為主，按壓松弛肌肉起止點(diǎn)，調(diào)整肢體力線。隔日治療1次，1周3次，共治療2周。

1.5.4 電針組：造模成功后1 d，根據(jù)比較解剖取穴法結(jié)合模擬骨度取穴法[5]，參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[6]取陰陵泉、陽(yáng)陵泉、內(nèi)外膝眼穴位，采用神經(jīng)刺激儀進(jìn)行電針刺激，頻率2/100 Hz，強(qiáng)度3 mA，20 min/次。隔日治療1次，1周3次，共治療2周。

1.5.5 抑制組：刃針抑制組和電針抑制組均在每次治療前的2 h內(nèi)給予關(guān)節(jié)腔注射抑制劑PF-562271(200 μmol/L，0.5 mL)，其余操作與對(duì)應(yīng)非抑制組(刃針組或電針組)相同。模型抑制組的抑制劑使用與上述同步進(jìn)行。隔日治療1次，1周3次，共治療2周。

1.6 觀察指標(biāo)檢測(cè)方法

1.6.1 標(biāo)本收集：各組干預(yù)結(jié)束后，采用10%水合氯醛按照2 mL/kg進(jìn)行耳緣靜脈注射，麻醉后處死所有白兔，打開(kāi)白兔的右下肢膝關(guān)節(jié)腔，剔除周?chē)g帶、滑膜、半月板等組織，分別用咬骨鉗在股骨髁以及脛骨平臺(tái)負(fù)重軟骨面迅速取出大約1cm×1cm的軟骨-骨標(biāo)本，用磷酸緩沖鹽溶液沖洗組織塊上的血液、黏液、污物等，置于液氮中速凍，然后置于-80℃冰箱凍存待檢。

1.6.2 光鏡觀察：取空白組和模型組的膝關(guān)節(jié)軟骨標(biāo)本，放入乙二胺四乙酸脫鈣液依次進(jìn)行脫水、透明、脫蠟，然后進(jìn)行石蠟包埋，切片厚度6 μm；采用蘇木精-伊紅染色法，光鏡下觀察兔膝關(guān)節(jié)軟骨情況。

1.6.3 蛋白免疫印跡分析：采用蛋白免疫印跡法檢測(cè)各組的膝關(guān)節(jié)軟骨組織整合素β1、FAK、ERK1/2、p38、JNK蛋白表達(dá)水平。取膝關(guān)節(jié)軟骨組織，采用細(xì)胞裂解法提取總蛋白，采用二喹啉甲酸法蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢驗(yàn)蛋白濃度后行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，濃縮膠恒壓80 V，約20 min，分離膠恒壓160 V。電泳結(jié)束后，于硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)移電泳槽以恒流200 mA轉(zhuǎn)膜 2 h，聚偏二氟乙烯膜在5%的脫脂牛奶，37℃恒溫中封閉2 h；洗膜后分別加整合素β1、FAK、p38、ERK1/2、JNK(1 ∶500稀釋)，4℃孵育過(guò)夜；PBST漂洗濾膜4次，5 min/次；加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(1 ∶5 000稀釋)，37℃孵育2 h，PBST 漂洗濾膜4次，5 min/次；按0.1 mL/cm2顯影液計(jì)算用量，將顯影液加在聚偏二氟乙烯膜上，室溫放置1 min，用保鮮膜包好。暗室中迅速將聚偏二氟乙烯膜蛋白貼在X光膠片上曝光，洗片機(jī)中顯影、洗像，然后采用Image J 軟件定量分析各目標(biāo)蛋白值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。其中計(jì)量資料若數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布則采用(x±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析；若數(shù)據(jù)不符合方差齊性，則采用Tamhane′s T2方法檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 動(dòng)物行為及光鏡下形態(tài)學(xué)的觀察結(jié)果 造模后的白兔患肢均有所收縮，活動(dòng)明顯減少，且伴輕度全身反應(yīng)癥狀(如周身顫抖、回頭、亂竄、掙扎)，輕度跛行，但蹬地有力。光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，空白組白兔的膝關(guān)節(jié)骨層次(例如表淺層、移行層、輻射層、鈣化層等)完整，而模型組白兔膝關(guān)節(jié)骨層次紊亂不清，且存在分層剝脫、細(xì)胞彌漫性增生、細(xì)胞簇集，見(jiàn)圖1。

圖1 空白組與模型組白兔膝關(guān)節(jié)的病理學(xué)表現(xiàn)(蘇木精-伊紅染色，×100倍)

2.2 7組兔膝關(guān)節(jié)軟骨整合素β1、FAK、p38、JNK及ERK1/2蛋白表達(dá)水平比較 與空白組對(duì)比，模型組整合素β1、FAK、p38、JNK及ERK1/2蛋白表達(dá)水平均升高(均P<0.05)。與模型組比較，刃針組、電針組的整合素β1、FAK、p38、JNK及ERK1/2蛋白表達(dá)水平均降低(均P<0.05)。與電針組對(duì)比，刃針組整合素β1、JNK及ERK1/2蛋白表達(dá)水平降低(均P<0.05)，而兩組FAK、p38表達(dá)水平比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。與對(duì)應(yīng)干預(yù)方法組比較，使用抑制劑的各組整合素β1、FAK、p38、JNK及ERK1/2蛋白表達(dá)水平下降(均P<0.05)。

表1 7組白兔膝關(guān)節(jié)軟骨相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較(x±s)

注：與空白組對(duì)比，*P<0.05；與模型組對(duì)比，#P<0.05；與刃針組對(duì)比，▲P<0.05；與電針組對(duì)比，●P<0.05。

3 討 論

目前，臨床上對(duì)早、中期KOA患者多采用保守治療，晚期則趨向于人工關(guān)節(jié)置換術(shù)?！敖?jīng)筋理論”認(rèn)為，KOA屬“經(jīng)筋痹”，以經(jīng)筋所屬筋肉、關(guān)節(jié)為主，治療上應(yīng)該以理筋活絡(luò)、解結(jié)消散為原則[7]。但由于缺乏傳統(tǒng)中醫(yī)理論指導(dǎo)治療KOA的分子生物學(xué)機(jī)制研究，以及現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)可的證據(jù)，導(dǎo)致其在醫(yī)學(xué)界的推廣應(yīng)用受到阻礙。探討中醫(yī)理論指導(dǎo)治療KOA的分子生物學(xué)機(jī)制具有重要意義。刃針療法是在小針刀基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)的一種更安全的微創(chuàng)療法，能較好地調(diào)節(jié)膝骨關(guān)節(jié)面的力學(xué)分布，恢復(fù)關(guān)節(jié)動(dòng)靜力平衡，降低肌肉、筋膜等軟組織的異常張力，對(duì)軟組織起到一種松懈作用。已有大量研究表明，“經(jīng)筋理論”指導(dǎo)下使用針刀治療KOA可取得很好的臨床效果[8-11]。因此，本研究旨在探討刃針干預(yù)促進(jìn)KOA緩解的可能力學(xué)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

KOA最早的病變部位源于關(guān)節(jié)軟骨。膝關(guān)節(jié)軟骨“磨損”是KOA的經(jīng)典病理改變，機(jī)械應(yīng)力在膝關(guān)節(jié)軟骨的病理性改變中起著重要作用[12]，而膝關(guān)節(jié)應(yīng)力不足或過(guò)度也會(huì)引發(fā)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡和細(xì)胞外基質(zhì)降解[13-14]。細(xì)胞信號(hào)通路在KOA的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到至關(guān)重要的作用。細(xì)胞信號(hào)通路不斷地將生理或病理的外界信號(hào)刺激(細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、力學(xué)信號(hào)等)傳遞至軟骨細(xì)胞內(nèi)，其異常表達(dá)會(huì)影響關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的生長(zhǎng)分化，造成關(guān)節(jié)軟骨退變。 整合素是關(guān)節(jié)軟骨表面的機(jī)械應(yīng)力的敏感受體[15]，本質(zhì)為細(xì)胞黏附分子，分為α和β兩種亞基型。其中，整合素β1在介導(dǎo)外界各種應(yīng)力刺激向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化的過(guò)程中起著重要作用[16]。FAK是整合素β1介導(dǎo)的信號(hào)通路中主要成分，其可與多種下游分子結(jié)合，使其磷酸化，并啟動(dòng)整合素下游的MAPK信號(hào)通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞功能。一旦MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑被激活，其通路中的關(guān)鍵蛋白(p38、JNK、ERK)會(huì)被磷酸化[17]，因此JNK、p38、ERK表達(dá)水平被作為反映MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是否被激活的指標(biāo)。其中，JNK參與多種細(xì)胞因子和應(yīng)力刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過(guò)程[18]；而p38則屬于MAPK家族中的應(yīng)激活化蛋白激酶，p38MAPK信號(hào)通路被激活后，能促進(jìn)炎癥因子、基質(zhì)金屬蛋白酶、前列腺素、環(huán)氧化酶等物質(zhì)的靶基因表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致軟骨成分丟失和破壞，從而產(chǎn)生相應(yīng)的炎癥反應(yīng)[19-20]；ERK可介導(dǎo)軟骨細(xì)胞終末分化、細(xì)胞增殖，是一條具有顯著特點(diǎn)的MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，也是控制軟骨細(xì)胞增殖、分化的主要途徑[21]。已有研究證實(shí)，ERK1/2能促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖和肥大細(xì)胞分化，從而使軟骨鈣化，骨贅形成[22]?？梢?jiàn)，p38、JNK、ERK都可以誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶，加速關(guān)節(jié)軟骨病理性降解，并參與軟骨細(xì)胞增殖、分化、凋亡等一系列反應(yīng)。因此FAK-MAPK這條介導(dǎo)的信號(hào)通路在調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞功能、抑制膠原和蛋白多糖合成以及其關(guān)鍵蛋白的表達(dá)將直接影響關(guān)節(jié)軟骨的完整性。

本研究中，模型組的白兔患肢活動(dòng)明顯減少，且伴輕度全身反應(yīng)癥狀及輕度跛行，光鏡下可見(jiàn)膝關(guān)節(jié)出現(xiàn)典型的病理改變，進(jìn)一步證實(shí)KOA模型成功建立。本研究模型組白兔的膝關(guān)節(jié)軟骨組織中整合素β1、FAK、p38、JNK、ERK1/2蛋白表達(dá)水平均高于空白組(P<0.05)，提示FAK-MAPK信號(hào)通路在KOA發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用：KOA所致關(guān)節(jié)制動(dòng)造成膝關(guān)節(jié)力學(xué)平衡失調(diào)，力學(xué)信號(hào)發(fā)生轉(zhuǎn)變，并傳導(dǎo)至細(xì)胞膜后調(diào)控相關(guān)的基因表達(dá)，使其構(gòu)型發(fā)生改變，造成軟骨成分丟失。有研究表明，針刺穴位能有效地剝離病灶部位的粘連，舒展攣縮，使動(dòng)態(tài)平衡失調(diào)得到糾正，促進(jìn)患膝關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)[22]。本研究中，在對(duì)白兔患膝關(guān)節(jié)進(jìn)行刃針或電針干預(yù)后也發(fā)現(xiàn)，刃針組和電針組白兔的膝關(guān)節(jié)軟骨組織中整合素β1、FAK、p38、JNK、ERK1/2蛋白表達(dá)水平均低于模型組(P<0.05)，提示刃針和電針通過(guò)調(diào)節(jié)FAK-MAPK信號(hào)通路，改變患膝關(guān)節(jié)力學(xué)應(yīng)力異常狀態(tài)，這或是其促進(jìn)KOA關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)的可能機(jī)制。同時(shí)，本研究結(jié)果還顯示，給予整合素β1、FAK、p38、JNK、ERK1/2的特異性抑制劑(PF-562271)預(yù)處理后，模型抑制組、刃針抑制組、電針抑制組的整合素β1、FAK、p38、JNK、 ERK蛋白表達(dá)水平分別低于模型組、刃針組、電針組(均P<0.05)。這提示特異性抑制劑PF-562271能夠抑制KOA白兔膝關(guān)節(jié)軟骨中整合素β1、FAK、p38、JNK、ERK1/2的表達(dá)，同時(shí)也說(shuō)明了FAK-MAPK力學(xué)信號(hào)通路或能介導(dǎo)刃針和電針干預(yù)的膝關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)過(guò)程。此外，刃針組的整合素β1、JNK、 ERK1/2蛋白表達(dá)水平均低于電針組(均P<0.05)，說(shuō)明刃針對(duì)FAK-MAPK這一力學(xué)轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)通路的干預(yù)作用可能更大。

綜上所述，F(xiàn)AK-MAPK信號(hào)通路在KOA發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用，而刃針治療可有效地降低KOA白兔FAK-MAPK信號(hào)通路中的整合素β1、JNK、ERK1/2蛋白的過(guò)度表達(dá)，且其干預(yù)作用優(yōu)于電針療法，這或是其促進(jìn)膝關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)的力學(xué)機(jī)制。由于本實(shí)驗(yàn)只是針對(duì)單一動(dòng)物(白兔)和單一的FAK- MAPK信號(hào)通路進(jìn)行觀察，是否還存在其他信號(hào)通路，或其與這些信號(hào)通路是否有交叉作用，目前尚未清楚，仍需更加全面而完整的實(shí)驗(yàn)研究來(lái)進(jìn)一步證實(shí)。