李志平，王加良?，張艷麗，張 凱，侯甲福

（1.牡丹江醫(yī)學院附屬紅旗醫(yī)院藥學部，黑龍江 牡丹江157011； 2.牡丹江醫(yī)學院附屬紅旗醫(yī)院麻醉科，黑龍江 牡丹江157011； 3.牡丹江醫(yī)學院藥學院，黑龍江 牡丹江157011）

九味沉香膠囊是臨床上用于治療冠心病、心絞痛、腦梗塞屬氣滯血瘀證的中成藥復方制劑，由沉香、廣棗、黃芪、川木香、肉豆蔻、當歸、西洋參等9 味藥材加工而成，方中沉香、川木香、廣棗行氣止痛、活血安神，合為君藥；附以黃芪補氣升陽、行滯通痹，當歸補血活血，西洋參補氣生津，肉豆蔻、訶子溫中行氣、澀腸止瀉，木棉花清熱利濕，諸藥合用，共奏益氣行滯、通絡止痛之功效。該制劑現(xiàn)行執(zhí)行標準為國家藥品標準WS-10854（ZD-0854） -2002-2012Z，但僅采用TLC 法對黃芪甲苷進行含有量測定［1］，也未檢索到相關定量測定的文獻報道。

中藥及其制劑中有效成分復雜多樣，具有多靶點的特點，僅測定單一組分含有量難以對其質(zhì)量進行全面準確的評價和控制，故多成分或特征性成分定量控制模式已逐步應用于中藥及其制劑的質(zhì)量控制中。一測多評法［2］通過測定制劑中對照品穩(wěn)定易得的1 種成分，利用中藥有效成分間存在的內(nèi)在函數(shù)關系，實現(xiàn)對多成分含有量的同時測定，可有效解決部分對照品不穩(wěn)定、難以獲得等不足，并降低了檢驗成本，2015 年版《中國藥典》 中已有9種中成藥應用該方法進行質(zhì)量控制。因此，本實驗采用一測多評法同時測定九味沉香膠囊中沉香四醇、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、木香羥內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯、肉豆蔻木脂素、去氫二異丁香酚的含有量，以期為全面評價該制劑質(zhì)量提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260 型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司），Waters 2695 型高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；BS210S 型電子天平［賽多利斯科學儀器（北京） 有限公司］；KH-300DB 型數(shù)控超聲儀（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥物 沉香四醇 （批號111980-201602，純度98.3%）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷（批號111920-201606，純度97.6%）、去氫二異丁香酚（批號110749-201919，純度97.1%） 對照品均購自中國食品藥品檢定研究院；芒柄花苷（批號PRF8081121，純度99.6%）、毛蕊異黃酮 （批號PRF8062601，純 度99.6%）、芒柄花 素 （批 號PRF8091225，純度99.9%） 對照品均購自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司；肉豆蔻木脂素 （批號CFS201901，純度98.0%）、木香羥內(nèi)酯 （批號CFS201802，純度98.1%）、去氫木香內(nèi)酯（批號CFS201801，純度98.0%） 均購自武漢天植生物技術有限公司。沉香、肉豆蔻、廣棗、當歸、川木香、黃芪、西洋參、訶子、木棉花均購自黑龍江國圣堂中藥飲片有限公司，經(jīng)黑龍江省牡丹江醫(yī)學院藥學院侯甲福副教授鑒定為正品，按均符合相關質(zhì)量標準檢驗規(guī)定。九味沉香膠囊（每粒裝0.3 g，批號1901202、1903218、1905203） 購自青海省格拉丹東藥業(yè)有限公司。乙腈、甲醇為色譜純（美國Tedia 公司）；其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液制備 精密稱取沉香四醇、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、木香羥內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯、肉豆蔻木脂素、去氫二異丁香酚對照品適量，甲醇分別制成0.278、0.434、0.252、0.178、0.732、2.854、1.696、0.472、0.138 mg／mL 貯備液，精密吸取適量，甲醇定容，即得（含13.9 μg／mL 沉香四醇、21.7 μg／mL 毛蕊異黃酮葡萄糖苷、12.6 μg／mL 芒柄花苷、8.9 μg／mL 毛蕊異黃酮、36.6 μg／mL 芒柄花素、142.7 μg／mL 木香羥內(nèi)酯、84.8 μg／mL去氫木香內(nèi)酯、23.6 μg／mL 肉豆蔻 木脂素、6.9 μg／mL 去氫二異丁香酚）。

2.2 供試品溶液制備 取九味沉香膠囊適量，倒出內(nèi)容物，研細，精密稱取1.0 g，精密加入25 mL甲醇，稱 定質(zhì)量，超 聲 （功 率300 W，頻 率40 kHz） 處理30 min，放冷，甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.3 陰性樣品溶液制備 按處方比例及生產(chǎn)工藝，分別制備缺沉香、缺黃芪、缺川木香、缺肉豆蔻的陰性樣品，按“2.2” 項下方法制備，即得。

2.4 色譜條件與專屬性考察 Agilent Zorbax SB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相［乙腈-甲醇（9 ∶1）］ （A） -0.1%甲酸（B），梯度洗脫（0～11.0 min，17.0%A；11.0～17.0 min，17.0%～26.0% A；17.0～35.0 min，26.0%～52.0% A；35.0～51.0 min，52.0%～66.0% A；51.0～64.0 min，66.0%～ 72.0% A；64.0～75.0 min，72.0%～ 17.0% A ）；體積流 量1.0 mL／min；0～35.0 min 在254 nm 波長處檢測沉香四醇、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素［3-9］，35.0～51.0 min 在225 nm 波長處檢測 木香羥內(nèi)酯、去氫木 香內(nèi)酯［5，10-12］；51.0～75.0 min 在270 nm 波長處檢測肉豆蔻木脂素、去氫二異丁香酚［5，13-14］；柱溫30 ℃；進樣量10 μL。取對照品、供試品、陰性樣品溶液，在“2.4” 項色譜條件下進樣測定，結果見圖1，可知各成分色譜峰與相鄰峰均能達到有效分離（分離度均＞1.5），理論塔板數(shù)按各成分計均不低于5 000，陰性無干擾。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.5 線性關系考察 精密吸取“2.1” 項下貯備液各適量，甲醇制成20 倍質(zhì)量濃度差的6 個混合標準溶液A～F，在“2.4” 項色譜條件下進樣測定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y） 進行回歸，結果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關系良好。

表1 各成分線性關系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.6 精密度試驗 精密吸取同一供試品溶液，在“2.4” 項色譜條件下進樣測定6 次，測得沉香四醇、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、木香羥內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯、肉豆蔻木脂素、去氫二異丁香酚峰面積RSD 分別為0.92%、0.75%、1.21%、1.18%、0.64%、0.56%、0.53%、0.87%、1.33%，表明儀器精密度良好。

2.7 重復性試驗 取同一批膠囊，按“2.2” 項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.4” 項色譜條件下進樣測定，測得沉香四醇、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、木香羥內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯、肉豆蔻木脂素、去氫二異丁香酚含有量 RSD 分別為 1.31%、1.46%、0.79%、1.63%、1.24%、1.16%、1.07%、1.55%、0.83%，表明該方法重復性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗 取膠囊適量，按“2.2” 項下方法制備供試品溶液，于0、2、4、6、12、18 h在“2.4” 項色譜條件下進樣測定，測得沉香四醇、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、木香羥內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯、肉豆蔻木脂素、去氫二異丁香酚色譜峰峰面積RSD 分別為0.86%、0.79%、1.15%、1.20%、0.68%、0.53%、0.57%、0.85%、1.31%，表明供試品溶液在18 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 加樣回收率試驗 取含有量已知的膠囊適量，傾出內(nèi)容物，研細，精密稱取9 份，每份0.5 g，分別精密加入對照品溶液（含0.186 mg／mL 沉香四醇、0.248 mg／mL 毛蕊異 黃酮葡 萄糖苷、0.142 mg／mL芒柄花苷、0.108 mg／mL 毛蕊異黃酮、0.446 mg／mL 芒柄花素、1.972 mg／mL 木香羥內(nèi)酯、1.154 mg／mL 去氫木香內(nèi)酯、0.272 mg／mL 肉豆蔻木脂素、0.098 mg／mL 去氫二異丁香酚） 0.5、1.0、1.5 mL，各3 份，按“2.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.4” 項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結果，沉香四醇、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、木香羥內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯、肉豆蔻木脂素、去氫二異丁香酚平均加樣回收 率分別 為 98.38%、99.26%、96.95%、97.55%、99.77%、100.12%、98.67%、97.99%、98.06%，RSD 分別為 1.12%、0.73%、1.22%、1.51%、0.82%、0.91%、1.33%、1.06%、1.36%。

2.10 相對校正因子計算 取“2.5” 項下混合標準溶液A～F，在“2.4” 項色譜條件下進樣測定，以木香羥內(nèi)酯為內(nèi)標，計算其他8 種成分的相對校正因子，結果見表2。

表2 各成分相對校正因子Tab.2 Relative correction factors of various constituents

2.11 耐用性考察

2.11.1 儀器、色譜柱 本實驗比較了Agilent 1260 型、Waters 2695 型色譜 儀，以 及Agilent Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Waters Symmetry C18（250 mm×4.6 mm，5 μm） 色譜柱對相對校正因子的影響，結果見表3，可知均無明顯影響（RSD＜2.0%）。

2.11.2 柱溫 本實驗比較了柱溫25、28、30、32、35 ℃） 對相對校正因子的影響，結果見表4，可知均無明顯影響（RSD＜2.0%）。

2.12 色譜峰定位 以內(nèi)標（木香羥內(nèi)酯） 為基準峰，計算“2.11.1” 項下儀器、色譜柱中8 種成分的相對保留時間，結果見表5，可知均無明顯影響（RSD＜2.0%）。

2.13 樣品含有量測定 取3 批膠囊適量，傾出內(nèi)容物，按“2.2” 項下方法制備供試品溶液，各平行3 份，在“2.4” 項色譜條件下進樣測定，計算含有量，結果見表6，可知一測多評法所得結果與外標法接近，相對平均偏差（RAD） 均＜2.0%。

表3 不同儀器、色譜柱對相對校正因子的影響Tab.3 Effects of different instruments and columns on relative correction factors

表4 不同柱溫對相對校正因子的影響Tab.4 Effects of different column temperatures on relative correction factors

表5 各成分相對保留時間Tab.5 Relative retention time of various constituents

表6 各成分含有量測定結果（mg／粒， n＝3）Tab.6 Results of content determination of various constituents （mg／capsule， n＝3）

3 討論

3.1 梯度洗脫條件篩選 本實驗首先考察了流動相甲醇-水［5，13］、乙腈-水、［乙腈-甲醇（9 ∶1）］ -水［6］對各成分的分離效果，發(fā)現(xiàn)以［乙腈-甲醇（9 ∶1）］ -水洗脫時較理想，但存在基線不平穩(wěn)、沉香四醇和毛蕊異黃酮色譜峰分離度不佳等不足，故水相采用一定濃度的酸（0.1%甲酸［3-5，7］、0.1%磷酸［14］、0.1% 冰醋酸），并對有機相、水相比例不斷進行摸索，最終確定采用 ［乙腈-甲醇（9 ∶1）］ 與0.1%甲酸作為流動相，按“2.4” 項下比例進行梯度洗脫，此時各成分均能達到有效分離，而且峰形對稱。

3.2 提取方法篩選 本實驗在制備供試品溶液時，考察了提取溶劑（75%甲醇［14］、甲醇［5-6，10］、75%乙醇［13］、乙 醇［3-5，7］）、提取方 法 （超 聲［3-6，10-11］、加熱回流［5，7］）、提取時間（20、30、40 min），發(fā)現(xiàn)甲醇超聲提取30 min 時各成分綜合提取率最佳，而且雜質(zhì)峰較少。

4 結論

本實驗建立一測多評法對九味沉香膠囊中沉香四醇、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、木香羥內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯、肉豆蔻木脂素、去氫二異丁香酚含有量同時進行測定，通過耐用性考察、色譜峰定位，并與外標法所得結果進行比較，發(fā)現(xiàn)該方法操作簡便，結果準確，重復性好，與外標法實測值無明顯差異，可為全面評價該制劑質(zhì)量提供參考。