李軍紅

(廣西柳州市人民醫(yī)院優(yōu)生遺傳門診，柳州市 545001，電子郵箱：ljhong0725@sohu.com)

中國是出生缺陷高發(fā)國家之一,出生缺陷發(fā)病率為5.6%[1],除了明顯的嚴(yán)重畸形外，還包括一些微小畸形，這些超聲異常與胎兒染色體異常存在著一定的相關(guān)性，其中染色體畸變約占出生缺陷遺傳病因的80%以上[2]。近年來超聲醫(yī)學(xué)不斷發(fā)展，為臨床診斷提供更多的人體組織生理和病理變化信息。超聲檢查兼有無創(chuàng)、便捷、價(jià)廉、實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)等優(yōu)點(diǎn)，產(chǎn)前超聲是篩查宮內(nèi)胎兒畸形的首選影像學(xué)方法，具有較高的敏感度，有利于降低出生缺陷發(fā)生率，對干預(yù)出生人口質(zhì)量具有重要的臨床價(jià)值[3-5]。

長期以來，染色體核型分析技術(shù)是確診染色體畸變的金標(biāo)準(zhǔn)，而在產(chǎn)前超聲提示多發(fā)結(jié)構(gòu)畸形胎兒中，染色體核型分析的陽性率更高[6]。但其檢測周期長、分辨率低，無法檢測5 Mb以下的拷貝數(shù)變異(copy number variation,CNV)。研究表明，將染色體微陣列分析(chromosomal microarray analysis，CMA)基因芯片技術(shù)運(yùn)用于胎兒超聲異常相關(guān)的CNV檢測，可為超聲提示一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)異常的病例診斷提供有效的信息[7]。本研究應(yīng)用染色體核型分析和基因芯片檢測等遺傳學(xué)檢測方法，對112例產(chǎn)前超聲提示胎兒異常的羊水或絨毛組織樣本進(jìn)行檢測，從而綜合評估胎兒預(yù)后情況,減少出生缺陷。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018年1月至2019年7月我院產(chǎn)前超聲提示胎兒異常(結(jié)構(gòu)異?；蜍浿笜?biāo)異常)的112例孕婦，納入標(biāo)準(zhǔn):(1)單胎妊娠；(2)均有完整的臨床資料。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)非自然妊娠者；(2)未接受跟蹤隨訪或失訪者。孕婦年齡22～43歲，平均32.5歲；孕周11～25周,平均18周。所有孕婦經(jīng)遺傳咨詢自愿簽署知情同意書進(jìn)行染色體核型分析及基因芯片檢測。其中99例行羊膜腔穿刺術(shù)取羊水進(jìn)行檢測，13例引產(chǎn)后取胎盤絨毛組織進(jìn)行檢測。

1.2 標(biāo)本取材 對妊娠17～25周的孕婦在超聲引導(dǎo)下定位穿刺點(diǎn),消毒腹部皮膚,無菌操作下采用一次性腰穿針經(jīng)腹抽取羊水26 mL，其中16 mL用于染色體核型分析，10 mL用于基因芯片檢測。對于妊娠11～17周的孕婦，將胎兒引產(chǎn)后取胎盤絨毛組織，用生理鹽水沖洗干凈后存放于生理鹽水玻璃瓶中，用于染色體核型分析及基因芯片檢測。

1.3 羊水細(xì)胞G顯帶染色體核型分析 采用ELITIST-5K型臺式離心機(jī)(鑫奧儀器儀表有限公司)將羊水以1 500 r/min離心10 min后，棄去上清液，取2 mL接種于羊水培養(yǎng)基(廣州白云山拜迪生物醫(yī)藥有限公司，批號：20190601)中，在5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1周，觀察細(xì)胞生長情況，鏡下見多個(gè)克隆時(shí)收集細(xì)胞備用。羊水細(xì)胞的收集、制片和顯帶：向培養(yǎng)瓶中加入20 μg/mL秋水仙堿50 μL，放入5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，將貼壁的羊水細(xì)胞用0.25%乙二胺四乙酸胰酶消化5 min，脫落后倒入離心管，以1 500 r/min離心10 min后棄去上清液；加入0.075 mol/L氯化鉀4 mL，以37℃水浴4 min，加入1.5 mL固定液(甲醇與冰醋酸按體積比3 ∶1混合)，再次以1 500 r/min離心10 min，棄掉上清，在沉淀物中加入8 mL固定液(甲醇與冰醋酸按體積比3 ∶1混合)，滴片，置于80℃烤箱中烘烤1.5 h，采用胰消化酶消化后以Giemsa染色顯帶。每份羊水標(biāo)本于鏡下觀察30個(gè)細(xì)胞分裂像，采用Karyo 3.2分析系統(tǒng)進(jìn)行染色體核型分析，當(dāng)出現(xiàn)異常核型或嵌合型，則擴(kuò)大分析至50個(gè)細(xì)胞分裂像。

1.4 絨毛組織染色體多重連接探針擴(kuò)增分析

1.4.1 DNA提取：使用滅菌剪刀與鑷子采集適量絨毛組織置入研磨管中，按照試劑盒說明書(MRC-Holland公司，批號：P290-B1)進(jìn)行DNA提取。于紫外分光光度計(jì)中測量DNA濃度及純度并稀釋，要求濃度為(30±5)ng/μL，A260/280為1.6～2.0。

1.4.2 DNA裂解變性：取4 μL DNA樣品小心加入做好標(biāo)記的PCR管底部(為防止反應(yīng)液揮發(fā)，使用進(jìn)口PCR管)，98℃加熱20 min后馬上取出，置于冰上3～5 min，注意動(dòng)作要迅速以防止降溫導(dǎo)致變性失敗。

1.4.3 DNA雜交：在變性后的DNA樣品中加入1.5 μL雜交液(0.75 μL多重鏈探針緩沖液+0.75 μL 探針混合液036/070，冰上配制，震蕩混勻)，放入PCR儀(羅氏公司)中雜交，反應(yīng)條件為95℃ 5 min、60℃ 16～20 h；溫度降至54℃。

1.4.4 連接反應(yīng)：在雜交產(chǎn)物中加入16 μL連接酶混合液(ddH2O 12.5 μL+連接酶緩沖液A 1.5 μL+連接酶緩沖液B 1.5 μL+Ligase enzyme 0.5 μL，冰上配制，用移液器輕輕吹打混勻后)，54℃溫浴20 min，接著98℃加熱5 min使連接酶失活，溫度降至20℃。

1.4.5 PCR反應(yīng)：加入5.05 μL PCR反應(yīng)液(ddH2O 3.8 μL+SALSA PCR引物混合液1 μL+PCR聚合酶0.25 μL，用移液器輕輕吹打混勻)，進(jìn)行PCR 反應(yīng)，反應(yīng)條件為95℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 1 min(共35循環(huán))、72℃ 20 min，15℃維持。

1.4.6 上機(jī)檢測：配制上樣緩沖液，即80 μL甲酰胺+1 μL DNA Size Standard-600。96孔板中每孔加入9 μL上樣緩沖液及1 μL PCR產(chǎn)物，吹打混勻。加樣時(shí)小心加入96孔板中的底部(不可產(chǎn)生氣泡)，再加上1滴液狀石蠟覆蓋。參照Beckman GeXP遺傳分析儀操作說明進(jìn)行檢測并采集數(shù)據(jù)，使用Coffalyser.Net軟件分析結(jié)果。

1.5 羊水或絨毛組織CMA基因芯片分析 (1)取10～15 mL羊水或使用生理鹽水收集的絨毛組織，1 000 r/min離心10 min，取沉淀物轉(zhuǎn)入1.5 mL的EP管。加入20 μL蛋白酶K及4 μL RNase A反應(yīng)30 min以溶解蛋白及去除RNA(組織樣本需先加入200 μL ATL，56℃金屬浴10 min對組織進(jìn)行初步消化處理)。(2)樣本加入200 μL AL緩沖液 ，并56℃金屬浴10 min對樣本進(jìn)行消化，再加入200 μL無水乙醇沉淀DNA，轉(zhuǎn)入離心柱含收集管組件中，8 000 r/min離心1.5 min，去除廢液；往離心管中加入500 μL AW1緩沖液，8 000 r/min 離心1.5 min，去除廢液；往離心管中加入500 μL AW2緩沖液，14 000 r/min離心 1.5 min，重復(fù)2次，第2次離心時(shí)長為3 min，以去除離子、蛋白等雜質(zhì)；將收集管去除，離心柱轉(zhuǎn)至1.5 mL EP管，滴加35 μL AE緩沖液至離心管中，放置5 min，8 000 r/min 離心1.5 min洗脫回收DNA，使用Thermo Scientific NanoDrop 2000紫外分光光度計(jì)測定DNA質(zhì)量。(3)取400 ng樣本及參比DNA轉(zhuǎn)入八聯(lián)管不同孔中，每孔加入2.5 μL隨機(jī)引物，95℃ 3 min熱片段化。配置含有熒光素的標(biāo)記混合液，樣本DNA的標(biāo)記混合液包含5 μL 5×反應(yīng)緩沖液、2.5 μL 10×dNTPs、1.5 μL Cy 5-dUTP熒光素、0.5 μL Exo(-)Klenow酶，參比DNA的標(biāo)記混合液包含5 μL 5×反應(yīng)緩沖液、2.5 μL 10×dNTPs、1.5 μL Cy 3-dUTP熒光素、0.5 μL Exo(-)Klenow酶。將含有熒光素的標(biāo)記混合液加入每個(gè)樣本及參比DNA中。放入37℃水浴孵育2 h，轉(zhuǎn)至65℃水浴10 min滅活酶，后置于冰上或保持4℃溫度內(nèi)避光。使用480 μL 1×TE(pH值為8.0)對已標(biāo)記樣本和參比DNA進(jìn)行兩次純化，之后對樣本和參比DNA進(jìn)行濃縮干燥，并使用定容1×TE(pH值為8.0)至8 μL，使用Thermo Scientific NanoDrop 2000紫外分光光度計(jì)測定DNA質(zhì)量，然后將已純化好標(biāo)記這兩種不同熒光素的樣品和參比DNA按1 ∶1等濃度配比混合轉(zhuǎn)入八聯(lián)管中。(4)配置雜交混合液，包含2 μL Cot-1 DNA(1.0 mg/mL)、4.5 μL 10×aCGH Blocking Agent、22.5 μL 2×HI-RPM雜交緩沖液；將雜交混合液加入每個(gè)樣本八聯(lián)管中，放入98℃孵育3 min，再轉(zhuǎn)入37℃ 孵育30雜交混合液，對非特異重復(fù)序列封閉進(jìn)行預(yù)雜交。預(yù)雜交完成后將樣本再轉(zhuǎn)移進(jìn)芯片孔中進(jìn)行封片，放入65℃雜交爐雜交24 h。 (5)用玻璃洗缸提前備好兩缸清洗液1和一缸清洗液2，清洗液2提前2 h預(yù)熱至37℃。完成雜交的芯片下雜交爐后在清洗液1中拆開封片，將芯片架入在清洗液1中洗滌5 min，轉(zhuǎn)架入清洗液2中洗滌1 min，緩慢提起。(6)清洗好的芯片裝入芯片架，通過Agilent SureScan Dx微陣列芯片掃描儀進(jìn)行激光掃描，Cy5激發(fā)后為紅光，Cy3激發(fā)后為綠光，比較兩種熒光激發(fā)后的光強(qiáng)，當(dāng)紅光更強(qiáng)時(shí)提示樣本染色體區(qū)域可能存在拷貝數(shù)增加，綠光更強(qiáng)時(shí)提示樣本染色體區(qū)域可能存在拷貝數(shù)缺失，使用Agilent CytoGenomics 2.7.22.0分析軟件將信號數(shù)據(jù)熒光信號強(qiáng)度轉(zhuǎn)換成Log Ratio值后呈現(xiàn)每個(gè)樣本的結(jié)果。

本實(shí)驗(yàn)采用香港中文大學(xué)設(shè)計(jì)的Fetal DNA Chip Version 2.0,包含6萬個(gè)探針。通過查詢OMIM(https://www.omim.org/)、UCSC(http://genome.ucsc.edu/)、ISCA(https://www.iscaconsortium.org/)、DGV(http://dgv.tcag.ca/dgv/app/home)、DECIPHER(https://decipher.sanger.ac.uk/)等數(shù)據(jù)庫，確定基因組DNA CNV的類型及臨床意義，必要時(shí)需采集雙親的外周血，以確定其來源并進(jìn)行臨床分析。根據(jù)美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)會(huì)發(fā)布的《序列變異解讀標(biāo)準(zhǔn)和指南》[8]對結(jié)果進(jìn)行判讀，檢測結(jié)果分為致病性CNV、臨床意義不明CNV及良性CNV。

2 結(jié) 果

在112例產(chǎn)前超聲異常的胎兒中，檢測出17例染色體核型異常，其中21-三體3例，18-三體1例，性染色體異常2例，平衡易位2例，染色體正常多態(tài)性變異8例，嵌合體1例；12例基因芯片異常，包括7例致病性CNV和5例臨床意義不明CNV；有6例同時(shí)存在染色體核型異常和基因芯片異常；有6例染色體核型正常而基因芯片異常，包括4例臨床意義不明CNV和2例致病性CNV；有11例染色體核型異常但基因芯片正常，包括染色體平衡易位2例，倒位4例，多態(tài)性變異5例。見表1。

表1 23例染色體核型或基因芯片異常病例的檢測結(jié)果及妊娠結(jié)局

3 討 論

本研究中112例產(chǎn)前超聲異常的胎兒中，共17例染色體核型異常，其中8例為異常染色體(包括21-三體3例，18-三體1例，性染色體異常2例，平衡易位2例)，檢出率為7.14%(8/112)，高于一般人群染色體疾病的發(fā)病率(0.5%)[9]，這提示產(chǎn)前超聲檢查異常的胎兒可能有較高的染色體異常風(fēng)險(xiǎn)。

長期以來，染色體核型分析技術(shù)是染色體畸變產(chǎn)前診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但其培養(yǎng)細(xì)胞及檢測周期長，分辨率低，未能檢測出5Mb以下的CNV。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在染色體核型分析正常但超聲結(jié)果異常的胎兒中，有6%～7%的胎兒存在明顯致病性或可能致病性的CNV[10-12]。因此，傳統(tǒng)的胎兒染色體檢測方法已經(jīng)不能滿足臨床對疾病診斷的需求，而結(jié)合基因芯片檢測技術(shù)對染色體數(shù)目異常、大片段缺失、重復(fù)以及致病性基因組CNV等染色體畸變進(jìn)行及時(shí)、準(zhǔn)確的產(chǎn)前診斷，將有利于進(jìn)一步減少活產(chǎn)兒的嚴(yán)重出生缺陷[13]。本研究中，共檢出12例基因芯片異常，其中有6例基因芯片異常但染色體核型正常，占5.36%，包括4例臨床意義不明CNV和2例致病性CNV。由此可見，進(jìn)行CMA基因芯片技術(shù)檢測有助于染色體CNV的檢出。在本研究染色體核型正常而基因芯片異常的胎兒中，1例胎兒超聲提示永存動(dòng)脈干，檢測染色體核型正常，但基因芯片發(fā)現(xiàn)染色體22q11.21區(qū)域缺失，缺失片段大小為2.45 Mb；我們將胎兒不良預(yù)后告知后，孕婦及家屬最終選擇終止妊娠，同時(shí)建議孕婦及其丈夫行基因芯片檢測，確定胎兒異常病因來源以指導(dǎo)再次妊娠。因此，CMA基因芯片技術(shù)還有利于在產(chǎn)前臨床咨詢中正確評估胎兒預(yù)后，為孕婦是否繼續(xù)妊娠提供更客觀的理論依據(jù)[14]。

但是，由于染色體的平衡性變異，不涉及遺傳物質(zhì)的丟失或增加，故基因芯片無法檢出，因此染色體核型分析仍是最佳的檢測手段。本研究結(jié)果顯示，有11例染色體核型分析異常但基因芯片正常，包括染色體平衡易位2例，倒位4例，多態(tài)性變異5例。雖然基因芯片是分析基因CNV的高分辨率檢測工具，在檢測速度、自動(dòng)化程度、覆蓋面和分辨率等方面均較傳統(tǒng)的染色體核型檢測有明顯提高，但基因芯片仍有其局限性。因此，將CMA基因芯片技術(shù)聯(lián)合傳統(tǒng)的染色體核型檢測，可彌補(bǔ)相互間的不足，達(dá)到最佳的檢測效果，尋找出遺傳學(xué)病因，從而有效減少出生缺陷兒[15]，提高人口素質(zhì)，減輕家庭和社會(huì)負(fù)擔(dān)。

綜上所述，產(chǎn)前超聲異常的胎兒可能有較高的染色體異常風(fēng)險(xiǎn)，因此建議常規(guī)行染色體核型分析及基因芯片檢測。同時(shí)使用兩種檢測方法可彌補(bǔ)相互間的不足，達(dá)到最佳檢測效果，有利于發(fā)現(xiàn)遺傳學(xué)病因，更好地評估胎兒預(yù)后，從而在遺傳咨詢中提供進(jìn)一步的明確建議，減少出生缺陷患兒，這對優(yōu)生優(yōu)育工作、提高人口素質(zhì)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。