史琳娜 呂蕊花 賈永軍 任 革 韓 冬 張宏方 賀太平

(1 陜西中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)技學(xué)院，西咸新區(qū) 712046，電子郵箱：selina-007-520@163.com；2 陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院影像科，咸陽(yáng)市 712000)

【提要】 液體活檢是一種非侵入性的新型診斷技術(shù)，主要檢測(cè)體液中的游離循環(huán)腫瘤細(xì)胞、循環(huán)腫瘤DNA、外泌體、循環(huán)RNA等生物標(biāo)志物，被廣泛用于疾病分子診斷、療效監(jiān)測(cè)和預(yù)后評(píng)估。近年來(lái)，隨著研究的深入及檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，液態(tài)活檢在肺癌診療中的應(yīng)用日益廣泛。本文就近年來(lái)液體活檢技術(shù)在肺癌診療中的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

肺癌是導(dǎo)致全球癌癥相關(guān)發(fā)病率和死亡率上升的主要原因，早期診斷率僅為15%，約75%的患者確診時(shí)已處于局部晚期或轉(zhuǎn)移階段[1]。目前，臨床常用的肺癌篩查方法主要包括痰脫落細(xì)胞學(xué)檢查、支氣管鏡檢查、胸部X光、低劑量計(jì)算機(jī)斷層掃描和肺組織活檢等[2]。痰脫落細(xì)胞學(xué)檢查具有無(wú)創(chuàng)、經(jīng)濟(jì)、實(shí)用、簡(jiǎn)單、快速的優(yōu)點(diǎn)，但敏感性差[3]。支氣管鏡檢查是診斷疑似肺癌患者的主要方法，屬于侵入性的診療方法，并發(fā)癥多且敏感性個(gè)體差異較大[4]。胸部X光檢查不能完全顯示肺部病變，假陰性率高，敏感性為75%～80%[5]。低劑量計(jì)算機(jī)斷層掃描檢測(cè)肺部病變敏感性較高，但假陽(yáng)性率亦高，且有輻射暴露的風(fēng)險(xiǎn)[6]。肺組織活檢所需的組織樣本需通過(guò)手術(shù)獲得，取樣不足和腫瘤內(nèi)部的異質(zhì)性可降低檢測(cè)的準(zhǔn)確性[7]。液體活檢是一種非侵入性的新型診斷技術(shù)，相較于其他肺癌篩查方法，具有無(wú)創(chuàng)、標(biāo)本易獲得且可重復(fù)獲取的優(yōu)點(diǎn)，可用于肺癌的精準(zhǔn)治療、預(yù)后評(píng)估和療效監(jiān)測(cè)[8]。液體活檢檢測(cè)對(duì)象主要包括游離循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cell，CTC)、循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)、外泌體及循環(huán)RNA。其中CTC和ctDNA檢測(cè)是發(fā)展最迅速的兩個(gè)研究領(lǐng)域。本文對(duì)液體活檢在肺癌診療中的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為肺癌的精準(zhǔn)醫(yī)療提供更好的參考。

1 CTC

1.1 CTC的概念及檢測(cè)方法 CTC是從原發(fā)性腫瘤和/或轉(zhuǎn)移病變脫落并在血流中循環(huán)的腫瘤細(xì)胞，細(xì)胞表面可表達(dá)上皮細(xì)胞特異性分子，如上皮細(xì)胞黏附分子和細(xì)胞角蛋白，低表達(dá)白細(xì)胞特異性分子CD45[9]。與其他循環(huán)腫瘤生物標(biāo)志物相比，CTC的優(yōu)勢(shì)是可通過(guò)直接觀察CTC細(xì)胞形態(tài)確定腫瘤的惡性表型。此外，免疫細(xì)胞化學(xué)和熒光原位雜交可用于CTC的表型鑒定并檢測(cè)基因組變化。體外培養(yǎng)CTC建立永久性CTC細(xì)胞系，可用于各種體內(nèi)、體外的功能實(shí)驗(yàn)，并可用于藥物篩選，有助于腫瘤的個(gè)體化治療[10]。外周血中的CTC含量極低[1～10 CTC/(106血細(xì)胞·mL 血)]，因此，CTC分選富集技術(shù)是臨床應(yīng)用的重點(diǎn)和難點(diǎn)。目前CTC分選富集常用的方法有親和性富集法(包括上皮細(xì)胞因子陽(yáng)性富集法和白細(xì)胞去除法)、膜濾過(guò)分離腫瘤細(xì)胞技術(shù)、密度梯度離心法、微流控芯片技術(shù)、免疫磁珠技術(shù)、電泳技術(shù)、免疫熒光法等，各有優(yōu)缺點(diǎn)[11]，見(jiàn)表1。

表1 CTC分選富集技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)比較

1.2 CTC臨床應(yīng)用進(jìn)展 CTC包含多種細(xì)胞和亞細(xì)胞成分，通過(guò)分析其組分可獲取腫瘤的病變信息，如獲取DNA分析已知突變和發(fā)現(xiàn)新突變，獲取RNA可得到基因表達(dá)譜及進(jìn)行腫瘤細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析，CTC在肺癌的診斷、治療評(píng)估和復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)等方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，已廣泛應(yīng)用于臨床前研究和臨床試驗(yàn)[11]。研究發(fā)現(xiàn)葉酸受體陽(yáng)性的CTC可用于肺癌的早期診斷，其診斷Ⅰ期肺癌的敏感性和特異性分別為74.19%和73.08%，其受試者工作特征曲線的曲線下面積優(yōu)于癌胚抗原、神經(jīng)元特異性烯醇化酶、細(xì)胞角蛋白19片段等其他臨床腫瘤標(biāo)志物[12]。盡管化療、靶向小分子和免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療肺癌已顯示出顯著效果，但獲得性耐藥和腫瘤復(fù)發(fā)仍舊十分常見(jiàn)。Zhou等[13]的研究證實(shí)了CTC計(jì)數(shù)與肺癌患者癌胚抗原表達(dá)水平和轉(zhuǎn)移灶數(shù)量呈正相關(guān)，并能有效預(yù)測(cè)預(yù)后。Chinniah等[14]對(duì)48例接受化療的局部晚期肺癌患者進(jìn)行縱向血液CTC監(jiān)測(cè)，證實(shí)CTC可預(yù)測(cè)腫瘤復(fù)發(fā)并先于影像學(xué)證據(jù)出現(xiàn)。因此，通過(guò)連續(xù)取樣，對(duì)患者CTC進(jìn)行縱向分析、監(jiān)測(cè)腫瘤的演變，對(duì)腫瘤耐藥和復(fù)發(fā)研究具有重要意義[15]。

2 ctDNA

2.1 ctDNA的概念及檢測(cè)方法 ctDNA是從凋亡或壞死的腫瘤細(xì)胞中釋放出來(lái)的遺傳物質(zhì)，可反映腫瘤的遺傳特征。研究證實(shí)，ctDNA與腫瘤組織活檢中獲得的腫瘤突變譜具有較高的一致性，可作為治療效果評(píng)價(jià)指標(biāo)與治療后臨床隨訪的重要監(jiān)測(cè)指標(biāo)[16]。目前，ctDNA檢測(cè)技術(shù)主要包括等位基因特異性PCR、數(shù)字PCR和二代測(cè)序技術(shù)，每種技術(shù)都有各自的優(yōu)缺點(diǎn)[17]，見(jiàn)表2。

表2 ctDNA檢測(cè)方法的優(yōu)缺點(diǎn)比較

2.2 ctDNA臨床應(yīng)用進(jìn)展 ctDNA具有廣泛的臨床應(yīng)用價(jià)值，可用于肺癌靶向治療致癌驅(qū)動(dòng)基因(如鼠類肉瘤病毒癌基因、磷酸酶和張力蛋白同源物基因、表皮生長(zhǎng)因子受體基因、鼠類肉瘤濾過(guò)性毒菌致癌同源體B1基因等)的突變檢測(cè)，以實(shí)現(xiàn)腫瘤的精準(zhǔn)治療。中國(guó)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局于2015年2月批準(zhǔn)吉非替尼說(shuō)明書(shū)更新，更新后的說(shuō)明書(shū)指出在無(wú)法獲得腫瘤組織時(shí)，可通過(guò)血液ctDNA檢測(cè)表皮生長(zhǎng)因子受體基因突變指導(dǎo)吉非替尼治療[18]。研究表明，ctDNA(3 d)比組織樣本(10～14 d)能更快得到驅(qū)動(dòng)基因的檢測(cè)結(jié)果，且取樣方法簡(jiǎn)單并可重復(fù)取樣，實(shí)現(xiàn)了療效和耐藥性的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)[19]。Xing等[20]對(duì)36例肺腺癌患者在使用奧希替尼治療前后的ctDNA樣本進(jìn)行體細(xì)胞突變譜分析，發(fā)現(xiàn)ctDNA變化與治療效果和預(yù)后顯著相關(guān) 。一項(xiàng)針對(duì)納武利尤單抗治療晚期肺癌的研究證實(shí)，外周血中ctDNA濃度的降低預(yù)示療效和預(yù)后較好[21]。另有研究表明，從ctDNA中檢測(cè)驅(qū)動(dòng)基因—表皮生長(zhǎng)因子受體基因的突變豐度可反映表皮生長(zhǎng)因子受體靶向藥物的療效和預(yù)后，且比癌胚抗原和神經(jīng)元特異性烯醇化酶等常用生物標(biāo)記物更敏感[22]。綜上，ctDNA可指導(dǎo)肺癌治療，用于療效評(píng)價(jià)、耐藥性檢測(cè)和預(yù)后評(píng)估，在肺癌個(gè)體化治療和全程管理中具有巨大優(yōu)勢(shì)。

3 外泌體

3.1 外泌體的概念及檢測(cè)方法 外泌體可在血液、尿液、腦脊液、胸膜積液等多種體液中被檢測(cè)到，是直徑為30～100 nm的細(xì)胞外囊泡，由包括腫瘤細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞分泌產(chǎn)生，其主要功能是遞送各種生物分子(蛋白質(zhì)、DNA和RNA等)到靶細(xì)胞[23]。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體可促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移，促進(jìn)腫瘤血管生成，參與腫瘤免疫調(diào)節(jié)和耐藥性發(fā)生[24]。目前，基于外泌體的理化性質(zhì)和生化特性，學(xué)者們開(kāi)發(fā)了一系列分離技術(shù)，表3對(duì)其主要分離技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行了總結(jié)[25]。

表3 外泌體分離技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)比較

3.2 外泌體臨床應(yīng)用進(jìn)展 肺癌的形成和發(fā)展受多種因素和機(jī)制影響，肺癌細(xì)胞分泌的外泌體作為細(xì)胞間信息傳遞的介質(zhì)在這一過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用[26]。外泌體富含多種與肺癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的蛋白，如表皮生長(zhǎng)因子受體、鼠類肉瘤病毒癌基因蛋白、緊密連接蛋白和RAB蛋白家族等，這些蛋白可作為肺癌診斷的生物標(biāo)志物[27]。大量研究發(fā)現(xiàn)，外泌體中蛋白質(zhì)和RNA表達(dá)水平的改變與腫瘤進(jìn)展顯著相關(guān)，可作為評(píng)價(jià)肺癌預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物，進(jìn)而指導(dǎo)臨床治療。Sandfeld-Paulsen等[28]的研究證實(shí)外泌體膜結(jié)合蛋白紐約食管鱗狀細(xì)胞癌1、胎盤(pán)堿性磷酸酶、表皮生長(zhǎng)因子受體、凋亡相關(guān)基因2相互作用蛋白X和上皮細(xì)胞黏附分子與肺癌患者總體生存時(shí)間顯著相關(guān)。Liu等[29]的研究證實(shí)外泌體中微小RNA-10b-5p、微小RNA-23b-3p和微小RNA-21-5p水平與肺癌患者總體生存時(shí)間呈負(fù)相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)外泌體可干預(yù)肺癌的治療效果，例如外泌體的微小RNA-1246可通過(guò)促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖導(dǎo)致放療抗性增加[30]，外泌體鋅指E盒結(jié)合蛋白1 mRNA可誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞化療抗藥性的產(chǎn)生[31]，外泌體微小RNA-21通過(guò)下調(diào)蛋白酪氨酸磷酸酶和程序性細(xì)胞死亡蛋白4的表達(dá)，激活磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B通路，參與肺癌患者表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑獲得性耐藥的發(fā)生[32]。此外，外泌體還可以作為天然藥物載體，例如用外泌體包裹紫杉醇制備的新型納米制劑，在肺癌轉(zhuǎn)移小鼠模型中被證實(shí)有顯著治療效果[33]。隨著深入研究外泌體在肺癌發(fā)生發(fā)展中的生物學(xué)機(jī)制，將外泌體作為診斷和治療肺癌的新手段具有廣闊的前景。

4 循環(huán)RNA

循環(huán)RNA是指存在于血液或其他體液中的胞外RNA，包含mRNA、微小RNA、長(zhǎng)鏈非編碼RNA和其他類型RNA，由細(xì)胞主動(dòng)分泌和/或細(xì)胞凋亡后釋放產(chǎn)生。循環(huán)RNA參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，對(duì)腫瘤生長(zhǎng)發(fā)揮促進(jìn)或抑制作用。隨著二代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，通過(guò)篩查肺癌患者與正常對(duì)照人群體液樣本中差異表達(dá)的循環(huán)RNA，不僅可作為診斷/預(yù)后候選標(biāo)記物，還可成為潛在的治療靶點(diǎn)[34]。Luo等[35]發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)鏈非編碼RNA H19在肺癌患者血漿中明顯升高，可用于肺癌的輔助診斷。長(zhǎng)鏈非編碼RNA-MIR22HG被證實(shí)具有腫瘤抑制因子的作用，可作為肺癌新的治療靶點(diǎn)[36]。目前針對(duì)肺癌特異性循環(huán)RNA篩查的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)和臨床研究不斷涌現(xiàn)，循環(huán)RNA在肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用也逐漸被證實(shí)，循環(huán)RNA分子檢測(cè)技術(shù)將會(huì)在肺癌診斷和治療中發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。

5 小 結(jié)

液體活檢在肺癌診療中發(fā)揮著巨大作用，可用于肺癌的早期診斷、驅(qū)動(dòng)基因的檢測(cè)、治療方案的制定以及療效和復(fù)發(fā)的監(jiān)測(cè)，從根本上促進(jìn)腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展。液體活檢是一項(xiàng)具有挑戰(zhàn)性的新技術(shù)，隨著研究地不斷深入，越來(lái)越多的研究成果將有望實(shí)現(xiàn)成果轉(zhuǎn)化，從而更好地為臨床服務(wù)。為使液體活檢能更廣泛應(yīng)用于臨床，不僅需要提升檢測(cè)技術(shù)的靈敏度和特異性、擴(kuò)大臨床試驗(yàn)規(guī)模，還需要建立相應(yīng)的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，建設(shè)規(guī)范的監(jiān)管體系。