劉玉萍，姚悅悅，蔣泳汝，王修中?

(1.青島農(nóng)業(yè)大學 附屬醫(yī)院，青島266109； 2.青島農(nóng)業(yè)大學 化學與藥學院，青島266109)

白藜蘆醇，又稱為芪三酚，是一種多酚類化合物，其化學名稱為(E)-3，5，4-三羥基二苯乙烯，主要來源于花生、葡萄(紅葡萄酒)、虎杖、桑椹等植物，是一種天然的抗氧化劑，可以預防和治療腫瘤、動脈粥樣硬化、心腦血管疾病，也可降低血液黏稠度抑制血小板凝結和預防癌癥等[1]。目前，測定白藜蘆醇的方法主要有高效液相色譜法[2]、氣相色譜法[3]和毛細管電泳法[4]。盡管這些方法具有高的靈敏度，但是所用儀器昂貴，且需要專業(yè)技術人員操作。因此，需發(fā)展簡單、快速、靈敏的白藜蘆醇測定方法。

由丹麥學者RUZICKA 首次提出的流動注射(FIA)方法的運用，促進了分析過程的自動化，目前已經(jīng)廣泛滲透到分析化學領域[5]。FIA 可以用較簡單的試驗設備在廣泛的領域中實現(xiàn)自動化和高效率，還能夠通過單次測定提供有關樣品的不同稀釋程度，或樣品與試劑不同混合比例的多維信息[6-7]。與其他光學測定方法相比，化學發(fā)光法無需復雜的光路和分光元件，具有靈敏度高和重現(xiàn)性好的優(yōu)點，普通的實驗室可以根據(jù)自己的試驗需求，進行組裝，操作簡單方便[8-11]。目前報道的化學發(fā)光體系中，魯米諾是使用最普遍且量子產(chǎn)率較高的化學發(fā)光試劑之一。在堿性條件下，它可以被多種氧化劑氧化，由基態(tài)激發(fā)至激發(fā)態(tài)，發(fā)出波長425 nm 的光[12]，但其自身被氧化的反應速率較慢或發(fā)光強度較弱，如果有催化劑或增敏劑存在，其發(fā)光強度將大大增強。一些藥物可以作為催化劑或增敏劑，從而實現(xiàn)對藥物的直接或間接測定[13-14]。流動注射與化學發(fā)光法相結合，具有操作簡單、靈敏度高、線性范圍寬、容易自動化等特點。

白藜蘆醇能夠顯著增強魯米諾-鐵氰化鉀化學發(fā)光反應的強度。因此，本工作結合流動注射，考察了堿性介質中白藜蘆醇對魯米諾-鐵氰化鉀化學發(fā)光體系的催化性能，據(jù)此建立了簡單、快速測定白藜蘆醇的流動注射化學發(fā)光法，并將其用于紅葡萄酒中白藜蘆醇含量的測定。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

IFFM-E型流動注射化學發(fā)光分析儀；F-4600型熒光光譜儀；CF15RXII型落地離心機；PK-8D 型電熱恒溫水槽；PB-10型酸度計；G-2型恒溫加熱磁力攪拌器。

魯米諾儲備溶液:1×10－2mol·L－1，于4 ℃冰箱保存，放置一周，使用時用1×10－3mol·L－1氫氧化鈉溶液逐級稀釋。

白藜蘆醇標準儲備溶液:1.00×10－3mol·L－1，置于4 ℃冰箱保存，使用時適當稀釋。

所用試劑均為分析純，試驗用水為二次去離子水。

1.2 儀器工作條件

儀器包含一個主泵、一個副泵、一個三通閥、一個混合器和一個多功能化學發(fā)光檢測器，相連的計算機上有配套的參數(shù)控制軟件，實現(xiàn)流動注射的進樣和化學發(fā)光信號的采集。

將8×10－6mol·L－1魯 米 諾 溶 液、2×10－5mol·L－1鐵氰化鉀溶液通過主泵引入系統(tǒng)；由副泵將白藜蘆醇標準溶液引入系統(tǒng)。三路溶液經(jīng)過三通閥和一定長度的管路快速混合均勻后進入流通池，產(chǎn)生發(fā)光信號經(jīng)光電倍增管放大后，由計算機記錄并顯示信號強度。

儀器運行參數(shù)見表1。

表1 儀器運行參數(shù)Tab.1 Operating parameters of the instrument

1.3 試驗方法

將購于當?shù)爻械募t葡萄酒樣品經(jīng)減壓抽濾，除去其中的不溶性雜質顆粒，然后移取50 m L濾液于燒杯中，加熱至沸騰，持續(xù)2 min(以除去紅葡萄酒中揮發(fā)性芳香物質)，冷卻至室溫，以10 000 r·min－1轉速離心5 min，取上清液，按儀器工作條件進行測定。

2 結果與討論

2.1 發(fā)光反應條件的選擇

2.1.1 進樣次序

試驗考察了8×10－6mol·L－1魯米諾溶液、2×10－5mol·L－1鐵氰化鉀溶液和白藜蘆醇標準溶液的進樣次序對反應體系發(fā)光強度的影響。結果表明:以8×10－6mol· L－1魯 米 諾 溶 液、2×10－5mol·L－1鐵氰化鉀溶液作為載流，將白藜蘆醇標準溶液注入載流后，可以獲得基線穩(wěn)定、重現(xiàn)性好的化學發(fā)光曲線。試驗中將8×10－6mol·L－1魯米諾溶液、2×10－5mol·L－1鐵氰化鉀溶液通過主泵引入系統(tǒng)，由副泵將白藜蘆醇標準溶液引入系統(tǒng)。

2.1.2 堿性介質

動態(tài)電路總共會涉及滑動變阻器類型的串聯(lián)電路、滑動變阻器類型的并聯(lián)電路、開關類型的串聯(lián)電路、開關類型的并聯(lián)電路四個基本電路。本文采用從局部→整體→局部的分析方法，對四個基本電路進行完整、準確的分析，使學生能夠全面掌握動態(tài)電路中所遇到的問題，提高學生分析問題、解決問題的能力。

魯米諾-鐵氰化鉀體系在堿性介質中發(fā)生氧化還原反應所產(chǎn)生的發(fā)光強度最大。試驗考察了1×10－1，1×10－2，1×10－3mol·L－1的氫氧化鈉溶液和p H 10的0.01 mol·L－1碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖溶液分別作為堿性介質時對反應體系發(fā)光強度的影響。結果表明:在1×10－3mol·L－1的氫氧化鈉溶液中，試驗獲得的峰形較好且發(fā)光強度穩(wěn)定。試驗選擇堿性介質為1×10－3mol·L－1的氫氧化鈉溶液。

2.1.3 魯米諾溶液的濃度

化學發(fā)光試劑對反應體系發(fā)光強度有很大的影響。試驗考察了不同濃度的魯米諾溶液對反應體系發(fā)光強度的影響。結果表明:隨著魯米諾溶液濃度的增加，反應體系的發(fā)光強度逐漸增大；當魯米諾溶液的濃度大于8×10－6mol·L－1時，反應體系發(fā)光強度的增大程度逐漸減緩，基本趨于穩(wěn)定。試驗選擇魯米諾溶液的濃度為8×10－6mol·L－1。

2.1.4 鐵氰化鉀溶液的濃度

試驗考察了不同濃度的鐵氰化鉀溶液對反應體系發(fā)光強度的影響，結果見圖1。

由圖1可知:隨著鐵氰化鉀溶液濃度的增加，反應體系的發(fā)光強度先增大后減??；鐵氰化鉀溶液濃度為2×10－5mol·L－1時，反應體系的發(fā)光強度最大。試驗選擇鐵氰化鉀溶液的濃度為2×10－5mol·L－1。

2.2 干擾試驗

按試驗方法對4.00×10－7mol·L－1白藜蘆醇標準溶液進行干擾測定，結果表明:當相對誤差在±5%以內時，5 倍的檸檬酸、葡萄糖、抗壞血酸，20倍的Mg2＋、Ca2＋，50倍的淀粉、精糊、乳酸、乙醇，1 000倍的K＋、Na＋、NH4＋、Cl－、NO3－、SO42－均不干擾測定。

圖1 鐵氰化鉀溶液的濃度對反應體系發(fā)光強度的影響Fig.1 Effect of concentration of potassium ferricyanide solution on chemiluminescence intensity of reaction system

2.3 標準曲線和檢出限

圖2 白藜蘆醇標準溶液的濃度對魯米諾-鐵氰化鉀化學發(fā)光體系發(fā)光強度的影響Fig.2 Effect of concentration of resveratrol standard solution on chemiluminescence intensity of the chemiluminescence system of luminol and potassium ferricyanide

試驗結果表明:白藜蘆醇的線性范圍為1.00×10－8～1.00×10－6mol·L－1，線性回歸方 程為ΔICL＝5.000×109c＋1.728×102(ΔICL為加入白藜蘆醇后反應體系的發(fā)光強度與空白溶液發(fā)光強度的差值，c 為白藜蘆醇的濃度)，相關系數(shù)為0.999 5。

根據(jù)3倍信噪比計算方法的檢出限(3S/N)，結果為3.0×10－9mol·L－1。

2.4 精密度試驗

按試驗方法對4.00×10－7mol·L－1白藜蘆醇標準溶液平行測定11 次，測定值的相對標準偏差(RSD)為2.6%。

2.5 樣品分析

按試驗方法對紅葡萄酒樣品進行分析，并對其進行3個濃度水平的加標回收試驗，重復測定6次，樣品分析結果見表2。

表2 樣品分析結果(n＝6)Tab.2 Analytical results of the samples(n＝6)

由表2可知:回收率為95.9%～130%。

2.6 化學發(fā)光機理

魯米諾的發(fā)光機理研究較多，普遍認為其氧化產(chǎn)物，即激發(fā)態(tài)的3-氨基鄰苯二甲酸陰離子為發(fā)光體，其最大發(fā)射波長為425 nm[15-16]。為了研究魯米諾-鐵氰化鉀體系的反應機理，試驗采用熒光光譜儀(關閉激發(fā)光源)掃描其化學發(fā)光光譜，見圖3。

由圖3可知:魯米諾-鐵氰化鉀體系和魯米諾-鐵氰化鉀-白藜蘆醇體系的最大發(fā)射波長均為425 nm，白藜蘆醇的存在僅僅增加了發(fā)光強度，并沒有產(chǎn)生新的發(fā)光體，因此白藜蘆醇并沒有改變化學發(fā)光機理。白藜蘆醇結構中帶有酚羥基，可以被強氧化劑氧化成激發(fā)態(tài)，在返回基態(tài)的過程中釋放多余能量轉移給基態(tài)的3-氨基鄰苯二甲酸陰離子，從而產(chǎn)生更多激發(fā)態(tài)的中間體，返回基態(tài)時產(chǎn)生更強的化學發(fā)光信號。

另外，體系中的溶解氧在魯米諾的氧化過程中也起到了一定的作用，試驗對魯米諾-鐵氰化鉀-白藜蘆醇體系通氮氣除氧15 min，發(fā)現(xiàn)發(fā)光強度降低了約30%。這個現(xiàn)象說明該體系的化學發(fā)光反應需要溶解氧的參與。基于以上討論，推測其反應機理如下(hν 為光子能量):

白藜蘆醇＋O2＋OH－→超氧自由基

超氧自由基＋魯米諾＋鐵氰化鉀 →激發(fā)態(tài)的3-氨基鄰苯二甲酸陰離子

激發(fā)態(tài)的3-氨基鄰苯二甲酸陰離子 →基態(tài)3-氨基鄰苯二甲酸陰離子＋hν

本工作基于白藜蘆醇對魯米諾-鐵氰化鉀化學發(fā)光體系具有明顯的增敏作用，將流動注射和化學發(fā)光法結合為一體，采用魯米諾-鐵氰化鉀流動注射化學發(fā)光法測定紅葡萄酒中白藜蘆醇的含量。