鄭 佳，何臘平，陳翠翠，劉涵玉，陶 菡

（貴州省農畜產品貯藏與加工重點實驗室，貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550025）

酸奶由于富含功能菌、成分易消化而深受消費者喜愛[1]。不過當前市場上的酸奶品種偏少，未能完全滿足人們對高品質酸奶的需求。影響酸奶品質的主要因素有原料、菌株及發(fā)酵工藝參數(shù)。原料奶在發(fā)酵前需要補充糖分，而糖分一般是由淀粉質原料糖化制得。馬鈴薯是僅次于小麥、水稻、玉米之后的第4大糧食作物[2]，淀粉含量約10%以上，我國規(guī)劃有把馬鈴薯作為主糧的戰(zhàn)略。目前，馬鈴薯深加工還很欠缺，鑒于馬鈴薯富含糖少蛋白[3]，而牛奶含有豐富的蛋白質[4]，可將馬鈴薯與牛奶搭配組成全價營養(yǎng)食品。現(xiàn)有報道馬鈴薯酸奶相關產品，為避免馬鈴薯中龍葵素帶來的澀味，多用馬鈴薯汁或全粉混合發(fā)酵[5]，而選用鮮薯無疑可增加其營養(yǎng)成分。因此，本實驗采用新鮮馬鈴薯作為原材料，糖化后與牛奶適當復配發(fā)酵酸奶。

酸奶發(fā)酵另一個關鍵因素是菌株[6]，直接影響酸奶發(fā)酵的風味和質地與功能成分[7]。但是，我國產業(yè)化應用與酸奶發(fā)酵的有自主知識產權的菌株還很少?；诖?，本課題組前期篩選出了4 株有自主知識產權的降膽固醇優(yōu)良動物雙歧桿菌乳亞種（Bifidobacterium animalissubsp.lactis）BZ11[8]和BZ25[9]、類植物乳桿菌（Lactobacillus paraplantarum）SQ-4[10]、戊糖乳桿菌（L. pentosus）MT-4[10]，并在進一步推廣其產業(yè)化應用方面進行基礎研究。

心腦血管疾病是健康的第一殺手，同時血清膽固醇含量過高是心腦血管疾病的一個重要原因[11]，研究表明降膽固醇益生菌補充劑能夠提供一種新的非藥理學替代方法降低心血管危險因素[12-13]。乙醛及雙乙酰是酸奶發(fā)酵過程中產生的主要風味物質[14-15]，但目前鮮見菌株對主要風味物質乙醛及雙乙酰的影響研究，也鮮見降膽固醇菌株復配用于發(fā)酵乳制品的報道，需進一步完善和探索。

本研究主要對馬鈴薯鮮薯進行適當前處理，以將龍葵素去除到口感無澀味或澀味很弱，然后適當添加到牛奶中作酸奶發(fā)酵原料，課題組現(xiàn)具有自主知識產權的降膽固醇動物雙歧桿菌乳亞種BZ11、BZ25和降膽固醇乳酸菌SQ-4、MT-4，及市場上常用的乳酸菌如嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）Q-1、長雙歧桿菌（Bifidobacterium longum）BL1等中選擇出合適發(fā)酵酸奶的菌株，探討不同菌種及其適當組合對酸奶感官及乙醛、雙乙酰兩種風味物質的影響規(guī)律，并對產品進行理化性質分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株來源

動物雙歧桿菌乳亞種BZ11和BZ25、類植物乳桿菌SQ-4、戊糖乳桿菌MT-4為本實驗室自篩的擁有知識產權的優(yōu)良菌株。菌株BZ11和BZ25保藏在中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號分別為：CGMCC NO.10224和CGMCC NO.10225；菌株MT-4和SQ-4保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號分別為CCTCC M 2016001及CCTCC M 2016002。

長雙歧桿菌BL1篩選自雙歧桿菌三聯(lián)活菌片；動物雙歧桿菌乳亞種BB12篩選自丹麥科漢森相關嬰兒乳制品；嗜熱鏈球菌Q-1篩選自天友酸奶。

1.1.2 試劑與培養(yǎng)基

伊利脫脂乳粉、鮮馬鈴薯、某品牌酸奶（與實驗室制作酸奶同一生產日期） 市售；雙乙酰（化學純）上海Solarbio生物科技有限公司；鄰苯二甲醛、鄰苯二胺（均為化學純） 國藥集團化學試劑有限公司。

蛋白胨吐溫酵母抽提物葡萄糖（peptone tween yeast extract glucose，PTYG）培養(yǎng)基[16]、MRS（De Man,Rogosa and Sharpe）培養(yǎng)基[17]、MC（modified Chalmers）培養(yǎng)基[17]。

1.2 儀器與設備

SPX恒溫生化培養(yǎng)箱 上海恒科實業(yè)發(fā)展有限公司；SW-CJ-ID操凈工作臺 上海蘇凈實業(yè)有限公司；水套式二氧化碳培養(yǎng)箱 上海三騰儀器有限公司；pH計成都世紀方舟科技有限公司；1100高效液相色譜儀美國安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 馬鈴薯糖化工藝

將馬鈴薯去皮，切塊，浸泡30 min（除龍葵素到適度低量，以不感覺到澀味為準，保留適當?shù)土康凝埧貙】涤幸妫┖笾笫齑驖{，按0.2%加入耐高溫淀粉酶，再加入0.8%的糖化酶，60 ℃水浴3 h至糖化完全，取出滅酶20 min。使得糖化液中馬鈴薯質量濃度為0.33 g/mL。

1.3.2 酸奶發(fā)酵

用馬鈴薯糖化液配制一定濃度脫脂乳粉復原乳，均質后于90 ℃滅菌10 min，將滅菌的復原乳冷卻備用。確定糖化液中馬鈴薯質量濃度0.33 g/mL、乳粉質量分數(shù)12%、發(fā)酵溫度37 ℃、加糖量1.5%。選取實驗室現(xiàn)有的菌株BZ11、BZ25、BL1、BB12、MT-4、SQ-4和Q-1，按照一定的接種量接入所用菌種，發(fā)酵溫度為37 ℃，一定時間后得到酸奶樣品，4 ℃冰箱冷藏12 h后得到成品，以滴定酸度、pH值、色澤、滋味、氣味、組織狀態(tài)、酸甜度、凝乳時間、雙乙酰、乙醛質量濃度為考察指標，考察單菌、復合菌、接種量、菌種比例對馬鈴薯酸奶發(fā)酵的影響。每次改變一個變量考察變量的影響規(guī)律，本次考察變量的最適值在后續(xù)考察中保持不變。

1.3.3 感官評定

酸奶感官分別從外觀狀態(tài)和風味2 個方面進行評定。采用描述性分析方法對酸奶進行外觀描述并打分，同時對酸奶的風味協(xié)調性和風味強度進行評定并打分[18]，根據(jù)風味強度及協(xié)調性，選擇乙醛及雙乙酰質量濃度較合適的匹配度范圍，之后以該匹配度確定變量水平。感官評定標準[19-20]見表1。

表1 酸奶感官評分標準Table 1 Criteria for sensory evaluation of yogurt

1.3.4 酸奶指標測定

活菌數(shù)測定采用平板計數(shù)法；乙醛、雙乙酰檢測采用碘液滴定法及鄰苯二胺比色法[21]；蛋白質測定參照GB/T 5009.5—2003《食品中蛋白質的測定》；滴定酸度測定參照GB 5413.34—2010《乳和乳制品酸度的測定》；持水力測定參考Hernández等[22]方法；微生物指標測定參照GB 4789.35—2016《食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》及GB 19302—2010《發(fā)酵乳》。

1.3.5 游離氨基酸測定

采用鄰苯二甲醛柱前衍生以相高效液相色譜-紫外檢測法。將樣品以5%（V/V）三氯乙酸溶液沉淀后上樣，采用1100高效液相色譜系統(tǒng)，色譜柱為Agilent Hypersil ODS柱（250 mm×4.0 mm，5 μm）；流動相A（pH 7.2）為7.35 mmo/L醋酸鈉-三乙胺-四氫呋喃（500∶0.12∶2.5，V/V），流動相B（pH 7.2）為7.35 mmol/L醋酸鈉-甲醇-乙腈（1∶2∶2，V/V）；洗脫程序：0 min，8% B；0～17 min，8%～50% B；17～20.1 min，50%～100% B；20.1～24 min，100%～0% B。流動相流速1.0 mL/min；紫外檢測器發(fā)射波長338 nm；脯氨酸檢測波長262 nm；進樣量1 μL；柱溫40 ℃。氨基酸含量以外標法定量。

1.3.6 酸奶降膽固醇能力的測定

采用鄰苯二甲醛比色法[23]檢測菌種在酸奶中的降膽固醇作用。

1.4 統(tǒng)計分析

利用SPSS 19.0進行方差分析，P＜0.05，差異顯著。

2 結果與分析

2.1 菌株對馬鈴薯酸奶感官及風味的影響

將實驗室的4 株雙歧桿菌與2 株乳桿菌分別做單菌株發(fā)酵及混菌發(fā)酵?；炀l(fā)酵從雙歧桿菌中選擇2 株，乳桿菌中選擇1 株，糖化液馬鈴薯質量濃度0.33 g/mL，乳粉質量分數(shù)18%，接種量5%，37 ℃發(fā)酵，單菌株發(fā)酵時間為16 h，混合菌株發(fā)酵時間為13 h，得到其理化、感官及風味分析如表2所示。

表2 不同菌株發(fā)酵酸奶感官及風味分析Table 2 Sensory evaluation and flavor analysis of yogurts fermented with different strains

研究[24]表明乙醛質量濃度不小于5 mg/L時，才會產生明顯的感官風味。且酸奶中的風味化合物并非越多越好，只有當不同的風味化合物達到平衡時，酸奶才呈現(xiàn)誘人的香味。有報道稱酸奶的風味協(xié)調感與羰基化合物的含量和比例存在一定關系。Bottazzi等[25]認為在嗜熱鏈球菌發(fā)酵的酸乳中，要想得到所需要的香氣，雙乙酰與乙醛質量濃度比值為1更為合適，也有研究認為當比例為0.62～1.09更好。本研究對比了其協(xié)調性及風味強度，發(fā)現(xiàn)乙醛與雙乙酰的比值在1左右，其風味更好，且感官評分更高（≥70 分）。

由表2可知，不同菌種在發(fā)酵過程中產酸、凝乳及感官等存在菌種特異性。單菌株發(fā)酵中，乳桿菌較雙歧桿菌凝乳快，可能是由于其生長速率較雙歧桿菌快，產酸快。在發(fā)酵16 h后，單菌株發(fā)酵均達到凝乳狀態(tài)，其中BZ11的綜合感官評分更好，BL1發(fā)酵酸奶質地均勻緊密。復合菌株與單一菌株相比，凝乳時間均有很大程度提高，在混菌發(fā)酵中，產酸速率增加，pH值下降更快。各菌株間存在協(xié)同作用，復合發(fā)酵能縮短發(fā)酵時間，提高發(fā)酵速率[26]，BZ11、BL1、MT-4及Q-1組合無論是質地還是滋味氣味，較其他組合更好。

實驗表明雙乙酰和乙醛含量與菌株特異性及其相互作用有很大關系，尤其菌株組合明顯影響乙醛質量濃度。與現(xiàn)有報道一致，混菌發(fā)酵能明顯提高酸奶產品乙醛及雙乙酰質量濃度[27]。嗜熱鏈球菌及乳酸菌發(fā)酵酸奶的兩種風味物質含量高于雙歧桿菌，屬于產香優(yōu)異的商業(yè)菌株，而乳酸菌在發(fā)酵過程中繁殖較雙歧桿菌快，高濃度的活菌數(shù)更有利于風味物質的生成。

綜合考慮，菌株對酸奶發(fā)酵有重要影響，自篩專利菌株BZ11及MT-4產酸及感官較好，BL1發(fā)酵酸奶質地較好，Q-1風味更好，所以選擇BZ11、BL1、MT-4、Q-1這一組合考察后續(xù)的接種量和菌種比例對馬鈴薯酸奶的發(fā)酵的影響。調節(jié)各種子液濃度至5×108CFU/mL后接種，以其與原料體積比計算接種量及菌種比例。

2.2 接種量對馬鈴薯酸奶感官及風味的影響

合適的接種量可以延緩甚至消除延滯期，在較短的時間內獲得最佳的產酸，得到感官更好的產品。以接種量為梯度，糖化液馬鈴薯質量濃度0.33 g/mL，乳粉質量分數(shù)12%，BZ11、BL1、MT-4、Q-1菌種比例1∶1∶1∶1，發(fā)酵時間13 h，檢測接種量對酸奶感官品質的影響，結果見圖1。

圖1 接種量對馬鈴薯酸奶感官及風味的影響Fig. 1 Effect of inoculum size on sensory score and flavor components of potato incorporated yogurt

由圖1可知，馬鈴薯酸奶感官評分隨著接種量的增加呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢，接種量越大，凝乳越快，得到的酸奶產品pH值越低。接種量小于3%，凝乳慢，質地較軟，酸甜度不適宜；大于4%，發(fā)酵異味明顯，酸味太重，且質地較硬，有少量乳清析出。因此3%及4%的接種量符合傳統(tǒng)酸奶的感官要求。

隨著接種量的增加，乙醛質量濃度出現(xiàn)波動，而雙乙酰質量濃度一直在緩慢上升。接種量小于3%時，乙醛質量濃度隨接種量的增加而增加，大于3%，呈降低趨勢。目前認為，酸奶制作中乙醛的產生原因有糖酵解途徑產生的丙酮酸分解、氨基酸轉化分解以及DNA降解，雙乙酰是在糖酵解途徑及檸檬酸代謝途徑產生的。接種量直接影響發(fā)酵初期的活菌濃度，在低接種量下，菌株大都處于生長期，是代謝產物逐漸積累的過程，隨著接種量的增加，會產生大量的風味前體物質，從而導致乙醛及雙乙酰質量濃度增加。而接種量過高，初始活菌濃度高，菌株生長快，同時衰亡菌株增加，屬于發(fā)酵后期，乙醛通過乙醇脫氫酶系的作用向乙醇、乙酸及酯類轉變[28]。雙乙酰質量濃度在增加接種量時處于緩慢積累，后趨于平穩(wěn)的狀態(tài)，而其風味協(xié)調性在接種量4%及5%最為合適。綜上所述，4%接種量使得接種后酸奶菌種的初始濃度保持在2×107CFU/mL，最有利于感官及風味。

2.3 菌種比例對馬鈴薯酸奶感官及風味的影響

接種后，隨著發(fā)酵的開始，菌株進入延滯期，延滯期的長短影響菌株的生長及產酸[29]，且不同菌種之間存在相互作用，形成其獨特的生長模式，選擇適宜的菌種比例能更好地控制發(fā)酵過程。以菌種比例（11-1-M-Q）為梯度，糖化液馬鈴薯質量濃度0.33 g/mL，乳粉質量分數(shù)12%，接種量4%，發(fā)酵時間13 h，調節(jié)4 株種子液濃度至5×108CFU/mL，檢測菌種比例對馬鈴薯酸奶感官品質的影響。

圖2 菌種比例對馬鈴薯酸奶感官及風味的影響Fig. 2 Effect of ratio among four selected strains on sensory score and flavor components of potato incorporated yogurt

由圖2可以看出，菌種比例對馬鈴薯酸奶產品的感官評分有很大影響，研究發(fā)現(xiàn)適當增加Q-1的比例，能獲得風味更好的產品，MT-4的比例過高，會加快產酸，引起酸奶出現(xiàn)澀味及乳清析出等不良現(xiàn)象。各個菌株對色澤的影響較小，主要影響酸甜度、組織狀態(tài)、氣味及滋味。當BZ11、BL1、MT-4、Q-1的比例為1∶1∶1∶2時，得到的產品酸甜適宜，凝乳質地較好，且口感細膩綿綢。

對比不同比例下乙醛及雙乙酰的含量差異，圖2顯示，在各個比例中，產品雙乙酰質量濃度的變化不明顯，而菌種比例主要影響乙醛質量濃度的變化。增加Q-1的比例能不同程度增加乙醛的含量，但由于混菌發(fā)酵是菌株相互影響的過程，存在不同程度的協(xié)同作用，因此每個菌株對兩種風味物質的影響不能一概而論。相比之下除2∶2∶1∶1比例外，其余菌株的風味協(xié)調性均較好，而1∶1∶1∶2比例下的乙醛及雙乙酰質量濃度較高，且協(xié)調性同樣不錯。故選擇1∶1∶1∶2作為其發(fā)酵菌菌種比例。

2.4 馬鈴薯酸奶的理化及微生物水平

除感官評價外，馬鈴薯酸奶的理化性質及微生物水平能更全面地以映產品整體品質。以研究得到的最優(yōu)菌種比例組合及最適接種量發(fā)酵酸奶產品，對比其與市售酸奶理化品質上的差異。

表3 馬鈴薯酸奶的理化品質Table 3 Physicochemical quality of potato incorporated yogurt

由表3可知，馬鈴薯酸奶理化指標符合國家標準，而且具有一些突出優(yōu)點：益生菌馬鈴薯酸奶含糖量（1.94%）較低，未經(jīng)調配就能達到與市售酸奶相同的質地口感，其蛋白質含量優(yōu)于普通市售酸奶，游離氨基酸水平高，這些都是由于馬鈴薯除了提供糖類物質外，其糖化后剩余纖維素及果膠類物質還能增加黏稠度，提高質地水平。馬鈴薯酸奶與市售酸奶的主體風味物質有很大差別，馬鈴薯酸奶能帶給產品獨特的柑橘香及果香。

此外，檢測到馬鈴薯酸奶的益生菌總活菌數(shù)為6.3×108CFU/mL，且其中雙歧桿菌的數(shù)量達到3.6×108CFU/mL。活菌數(shù)越多，其在胃腸道定植的可能性越大。雙歧桿菌作為胃腸道益生性最好的菌群，由于其生長緩慢及厭氧生長等原因，在食品中的應用受到限制，但本實驗使用BZ11及BL1都有良好的耐氧特性，使酸奶成品的活菌數(shù)也達到較高濃度，滿足益生菌發(fā)揮益生作用濃度需達到1×106CFU/mL的要求，對人體腸道菌群平衡起到預防和調節(jié)的作用。

2.5 馬鈴薯酸奶游離氨基酸分析

表4 馬鈴薯酸奶游離氨基酸含量Table 4 Free amino acid contents of potato incorporated yogurt mg/100 g

酸奶的形成過程實際上是蛋白質變性凝固的過程，氨基酸作為蛋白質的組成部分，種類和含量是食品營養(yǎng)及風味的重要指標。其中，游離氨基酸含量主要參與風味物質的形成，而且其含量的多少也直接與蛋白質的水解程度和其被人體吸收利用的生物學效價呈正相關。表4中3 種樣品均檢測出17 種游離氨基酸，其中發(fā)酵前總游離氨基酸質量濃度為112.5 mg/100 g，是市售牛奶的3～5 倍，這與使用的原材料有關。馬鈴薯蛋白質含量雖較低，但它的加入在一定程度上增加了游離氨基酸水平，而且加熱糖化過程、均質及滅菌過程會發(fā)生蛋白質變性，其共價鍵遭到破壞，導致游離氨基酸增加[30]。實驗證明發(fā)酵后各游離氨基酸較發(fā)酵前有不同程度的升高，馬鈴薯酸奶的總游離氨基酸及必需氨基酸含量更高，其必需氨基酸百分比也更高。這是由于在發(fā)酵過程中部分蛋白質被微生物分解，形成小肽和氨基酸，這也大大提升了酸奶的生物學效價。

與市售酸奶相比，添加益生菌的馬鈴薯酸奶游離氨基酸含量更高，其中谷氨酸、精氨酸及丙氨酸含量較多。丙氨酸經(jīng)氨基酸脫羧以應可以生成乙醛。精氨酸作為人體必需氨基酸，在發(fā)酵前有20.84 mg/100 g。據(jù)報道[31]，脫脂乳中的精氨酸含量相對較少，所以含量較高的精氨酸可能來自于馬鈴薯本身或者原料操作過程中的加熱均質等步驟[30]。經(jīng)過發(fā)酵過程，游離精氨酸含量進一步增加（41.14 mg/100 g），作為風味物質前體，它能較快的參與美拉德以應，生成香味物質。

天冬氨酸、纈氨酸及酪氨酸經(jīng)過發(fā)酵過程含量下降。其中天冬氨酸是生物體其他氨基酸及嘌呤的合成前體，天冬氨酸的降低可能是轉化生成其他氨基酸。纈氨酸屬于支鏈氨基酸，在代謝過程中可能通過氨基酸轉移酶生成酮類，進一步轉化成醛醇類物質，產生與酸奶風味類似的水果及香甜味[32]。因此，菌種通過發(fā)酵過程參與游離氨基酸的轉化，一定程度上影響發(fā)酵前后的風味主體。

2.6 酸奶的降膽固醇作用分析

圖3 菌種對酸奶膽固醇的降解作用Fig. 3 Degradation percentage of cholesterol in yogurt by pure and mixed cultures of four strains

由圖3可知，在接種量5%、發(fā)酵溫度37 ℃、發(fā)酵時間16 h、乳粉18%、白砂糖0%、糖化液馬鈴薯質量濃度0.33 g/mL條件下，單菌株發(fā)酵都能不同程度降低酸奶中的膽固醇，而適當組合后，在接種量4%、發(fā)酵溫度37 ℃、發(fā)酵時間12.5 h、乳粉12%、白砂糖1.5%、糖化液馬鈴薯質量濃度0.33 g/mL條件下，菌株BZ11、BL1、MT-4及Q-1混合發(fā)酵對酸奶中的膽固醇降解率達到20.43%，較單菌株增加1.86%～15.57%。對比前后酸奶中的菌株的降膽固醇情況，發(fā)現(xiàn)混菌發(fā)酵會增加菌株的降膽固醇能力，其原因可能是由于混菌對降膽固醇具有協(xié)同作用。斯日古楞[33]用1 株嗜酸乳桿菌代替?zhèn)鹘y(tǒng)酸奶發(fā)酵劑中的保加利亞乳桿菌，在發(fā)酵酸奶過程中對牛奶中膽固醇的降解率達14.3%。因此可以看出，酸奶的降膽固醇作用與菌株自身有很大關系。

3 結 論

菌株是酸奶發(fā)酵的核心，研究發(fā)現(xiàn)不同菌株菌株、接種量及菌種比例影響馬鈴薯酸奶的感官及其風味，適宜發(fā)酵酸奶菌株為BZ11、BL1、MT-4、Q-1，接種量4%，菌種比例1∶1∶1∶2；混菌發(fā)酵菌株間互相影響風味物質的生成。對比益生菌馬鈴薯酸奶與市售酸奶的理化性質，發(fā)現(xiàn)馬鈴薯酸奶有更低的還原糖質量分數(shù)（1.94%）、更高的游離氨基酸含量和益生菌水平（6.3×108CFU/mL），尤其是雙歧桿菌達到3.6×108CFU/mL，這些顯著提高了酸奶的營養(yǎng)價值。體外降膽固醇實驗表明混菌發(fā)酵酸奶膽固醇降解率達到20.43%，較單菌株發(fā)酵酸奶提高1.86%～15.57%。通過本研究，找到了適合馬鈴薯酸奶發(fā)酵的組合菌株，且自篩的有自主知識產權菌株BZ11和MT-4表現(xiàn)出了一些優(yōu)于商業(yè)菌株的優(yōu)良特性。