徐 瓊,劉 洋,,曲勤鳳,竇同海,陳羽菲,張娜娜,趙 磊,鐘 江,翁史昱,楊捷琳,趙國(guó)屏
(1.上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)技術(shù)研究院,上海 200233;2.復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,上海 200433;3.上海海關(guān)動(dòng)植物與食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心,上海 200135)
腐乳是我國(guó)傳統(tǒng)的發(fā)酵豆制品,至今已有一千多年的生產(chǎn)歷史。它是用豆?jié){的凝乳狀物經(jīng)微生物發(fā)酵所制成的一種干酪型產(chǎn)品,故又被譽(yù)為“中國(guó)干酪”[1]。經(jīng)微生物發(fā)酵后的腐乳除大豆本身所具有較高蛋白質(zhì)、脂肪和大豆異黃酮[2]等營(yíng)養(yǎng)外,還具有抗氧化[3-4]、抗高血壓[5]、抗乙酰膽堿酯酶活性[6]等生理功能,深受人們的喜愛(ài)。
由于腐乳是半開(kāi)放式生產(chǎn),且大多為傳統(tǒng)的手工操作,未有加熱殺菌的過(guò)程,因此有可能被環(huán)境中的微生物雜菌污染[7],從而影響產(chǎn)品的品質(zhì),甚至給消費(fèi)者的安全帶來(lái)隱患。如腐乳中常見(jiàn)的生物胺,主要是由微生物對(duì)游離氨基酸的脫羧作用產(chǎn)生[8],諸如芽孢桿菌屬(Bacillus)、梭菌屬(Clostridium)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)和假單胞菌屬(Pseudomonas)均能產(chǎn)生脫羧酶[9-10]。此外,氨基甲酸乙酯[11]、腸毒素[12]、丙烯酰胺[13]也是常見(jiàn)的發(fā)酵過(guò)程中的微生物產(chǎn)生的副產(chǎn)物。
廖新浴等[14]利用純培養(yǎng)和16S rDNA測(cè)序相結(jié)合對(duì)不同類型腐乳優(yōu)勢(shì)菌群進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)不同腐乳中的菌群結(jié)構(gòu)各不相同,同時(shí)存在優(yōu)勢(shì)的食源性致病菌如蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)、糞腸球菌(Enterococcus faecalis)和惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)。由于該結(jié)果依賴于純培養(yǎng),對(duì)于含量較低和非可培養(yǎng)微生物可能有所遺漏,無(wú)法對(duì)樣品中的所有微生物群落進(jìn)行全面分析。
近年來(lái),隨著測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展,高通量測(cè)序技術(shù)也被稱為下一代測(cè)序技術(shù),由于成本低、可讀量和質(zhì)量高,是目前評(píng)估微生物多樣性的有力工具[15-16]。許多研究已經(jīng)將該技術(shù)用于發(fā)酵食品中菌群多樣性的分析,如豆豉[17]、豆汁[18]、大醬[19]、曲拉[20]等,但運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)分析華東、華北和東北地區(qū)腐乳菌群多樣性的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。
本研究以我國(guó)不同地區(qū)紅腐乳為研究對(duì)象,采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)細(xì)菌16S rDNA V1-V3區(qū)進(jìn)行測(cè)序,以期更加全面地了解不同地域紅腐乳中細(xì)菌菌群多樣性,明確各自的優(yōu)勢(shì)菌群,為建立地域性特色發(fā)酵食品提供理論依據(jù)。
紅腐乳樣品從我國(guó)6 個(gè)省市當(dāng)?shù)爻匈?gòu)買(mǎi),每例樣品來(lái)源于不同生產(chǎn)廠家,共計(jì)9 例,具體地區(qū)與樣品情況見(jiàn)表1。
表1 樣品信息Table 1 Information about the samples tested in this study
聚合酶鏈?zhǔn)揭詰?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)Master Mix(M7505) 美國(guó)Promega公司;膠回收試劑盒(Code No. 9762)、引物 寶生物工程(大連)有限公司。
SW22振蕩水浴槽 德國(guó)Julabo公司;Centrifuge 5417R冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司;Nanodrop2000超微量分光光度計(jì) 美國(guó)Thermo Scientific公司;VERITI梯度PCR儀 美國(guó)ABI公司;Sub-Cell電泳儀、Geldoc XR+型凝膠成像儀 美國(guó)Bio-Rad公司;MiSeq高通量測(cè)序平臺(tái) 美國(guó)Illumina公司。
1.3.1 核酸提取
采用十六烷基三甲基溴化銨(hexadecyltrimethylammonium bromide,CTAB)法[21]并稍作修改。取同批次樣品3 份,從每份樣品中倒取50 mL腐乳湯汁,共計(jì)150 mL。混合后,取混合樣品湯汁5 mL,9 000 r/min離心10 min,去上清液,沉淀中加入10 mL的無(wú)菌水,在振蕩器上振蕩混勻,9 000 r/min離心10 min,去上清液,沉淀加入800 μL溶菌酶(10 mg/mL),37 ℃水浴1 h;然后加入40 μL的蛋白酶K和CTAB裂解液,56 ℃水浴2 h。每管裂解液中加入等量Tris飽和酚-三氯甲烷-異戊醇(25∶24∶1,V/V),混勻,13 000 r/min離心10 min。取上清液至新離心管中,加入等體積三氯甲烷-異戊醇(24∶1,V/V),混勻,13 000 r/min離心10 min。上清液移至新離心管中,加入2 倍體積無(wú)水冰乙醇,混勻,靜置30 min左右,13 000 r/min離心2 min。棄上清液,用70%乙醇溶液洗滌沉淀2~3 次,得到的沉淀放置于室溫條件下進(jìn)行自然風(fēng)干。風(fēng)干后加入50 μL Tris-乙二胺四乙酸緩沖液,溶解沉淀。
1.3.2 PCR擴(kuò)增及16S rRNA測(cè)序
以提取的總細(xì)菌基因組D N A為模板,引物針對(duì)16S rRNA基因V1-V3區(qū)合成特異引物,利用27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和534R(5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR體系:基因組模板DNA 2 μL,2×PCR Master Mix 12.5 μL,正以引物各0.5 μL,ddH2O補(bǔ)足至25 μL。PCR擴(kuò)增條件:94 ℃預(yù)變性2 min;94 ℃變性30 s,60 ℃退火50 s;72 ℃延伸45 s,擴(kuò)增40 個(gè)循環(huán);4 ℃保存。對(duì)所得的PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè),對(duì)符合要求的PCR產(chǎn)物進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物經(jīng)純化回收后,使用Illumina MiSeq平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序及生物信息學(xué)分析。
高通量測(cè)序得到的雙端序列數(shù)據(jù)使用FASTQC(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc)進(jìn)行質(zhì)量控制。Raw data上的接頭使用CUTADAPT(http://code.google.com/p/cutadapt/)去除。然后使用FLASH(https://sourceforge.net/projects/fl ashpage/ fi les/)連接Pair-end兩端Reads。使用QIIME[22]篩選序列和嵌合體,嵌合體去除使用QIIME的Usearch[23]算法,參數(shù)默認(rèn)。
基于可操作分類單元(operational taxonomic units,OTU)聚類分析結(jié)果,研究環(huán)境中微生物的多樣性,使用QIIME分析流程中pick_open_reference方式進(jìn)行OTU聚類。聚類算法使用Uclust[23],數(shù)據(jù)庫(kù)使用Greengenes 2013-08 release(http://greengenes.lbl.gov/Download/)版本,相似度閾值為97%,對(duì)所有序列進(jìn)行OTU劃分并進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)分析,其余參數(shù)為QIIME默認(rèn)參數(shù)。根據(jù)樣本分析所得OTU情況使用QIIMEα_diversity分析模塊進(jìn)行α多樣性分析,其中菌群豐度可由Chao 1指數(shù)進(jìn)行評(píng)估,其數(shù)值越高表明群落物種豐富度越高;菌群多樣性由Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)進(jìn)行評(píng)估,Shannon指數(shù)與群落多樣性呈正相關(guān),與Simpson指數(shù)呈負(fù)相關(guān)。Coverage指數(shù)是測(cè)序深度指標(biāo),代表每個(gè)樣品文庫(kù)的覆蓋率。
使用β多樣性分析進(jìn)行不同樣品在微生物群落構(gòu)成上的比較。使用軟件QIIMEβ_diversity_through_plots,jackknifed_β_diversity模塊進(jìn)行β多樣性分析。在之前分析步驟中,已經(jīng)將序列按照其堿基組成的相似性,劃歸到各個(gè)OTU中。在進(jìn)行分類學(xué)分析時(shí),首先,將每一條典型序列都與Greengenes 2013-08 release(http://greengenes.lbl.gov/Download/)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì),找出其最相近且可信度達(dá)80%以上的種屬信息,以獲得每個(gè)OTU的分類學(xué)信息。根據(jù)物種注釋,統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣品在分類水平上的序列數(shù)目,分類水平分別是門(mén)水平(將相對(duì)豐度<0.1%及unidentified歸入others)和屬水平(相對(duì)豐度<5%及unidentified歸入others)。使用軟件QIIME,算法為rdp_classifier[24]v2.2。熱圖使用R語(yǔ)言的“pheatmap”包繪制?;诰褐gUnifrac[25]算法加權(quán)的主坐標(biāo)分析(principal co-ordinates analysis,PCoA)可以實(shí)現(xiàn)多個(gè)樣品的分類。
α多樣性以映樣品內(nèi)部微生物群落的物種豐富度,根據(jù)97%相似性水平下的OTU信息,采用α多樣性指標(biāo)的Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和Chao 1指數(shù)對(duì)樣品微生物物種的豐富度和多樣性進(jìn)行評(píng)估,結(jié)果見(jiàn)表2。所有樣本的測(cè)序Coverage指數(shù)大于0.9,說(shuō)明腐乳樣品文庫(kù)種序列基本都被測(cè)出,未被測(cè)到的概率較低,測(cè)序結(jié)果可以以映樣品真實(shí)情況。由表2可知,東北地區(qū)樣品(R7和R8)的Chao 1指數(shù)和Simpson指數(shù)均低于其他樣品,說(shuō)明該地區(qū)紅腐乳樣品中細(xì)菌群落豐度和群落多樣性較低,與其他地區(qū)存在一定差異。
表2 紅腐乳樣品中細(xì)菌α多樣性Table 2 α-Diversity of bacteria present in red sufu samples
采用對(duì)測(cè)序序列進(jìn)行隨機(jī)抽樣的方法,以抽到的序列數(shù)與它們所能代表OTU數(shù)目構(gòu)建曲線,即稀釋性曲線。當(dāng)曲線趨于平坦時(shí),說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)量合理,更多的數(shù)據(jù)量對(duì)發(fā)現(xiàn)新OTU的邊際貢獻(xiàn)很?。灰灾畡t表明繼續(xù)測(cè)序還可能產(chǎn)生較多新的OTU。因此,通過(guò)作稀釋性曲線,可以得出樣品的測(cè)序深度情況。由圖1可知,多數(shù)樣本在序列數(shù)在接近10 000時(shí),OTU已經(jīng)接近飽和,再增加測(cè)序量對(duì)于發(fā)現(xiàn)新OTU的邊際貢獻(xiàn)很小。說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)量合理,所含菌種數(shù)較多?,F(xiàn)有測(cè)序量已經(jīng)可以以映樣品中細(xì)菌豐度信息。
圖1 各樣品中細(xì)菌稀釋曲線Fig. 1 Rarefaction curves of bacteria in samples
圖2 門(mén)水平下紅腐乳樣品中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分布Fig. 2 Distribution of bacterial communities in red sufu samples at phylum level
由圖2可知,紅腐乳中主要細(xì)菌優(yōu)勢(shì)門(mén)分別為:平均相對(duì)豐度為73.93%的厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、15.12%的放線菌門(mén)(Actinobacteria)以及9.63%的變形菌門(mén)(Proteobacteria)。不同地區(qū)紅腐乳中細(xì)菌主要優(yōu)勢(shì)菌群基本相同,但是相對(duì)豐度差異較大,即樣品R2和R8中放線菌門(mén)的相對(duì)豐度分別為42.21%和44.96%,而樣品R9的放線菌門(mén)相對(duì)豐度只有2.34%;R1中變形菌門(mén)的相對(duì)豐度是所有紅腐乳中最高的,達(dá)到31.63%。說(shuō)明在門(mén)水平下,不同地區(qū)紅腐乳中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成相同,僅組成比例存在一定差異。其中厚壁菌門(mén)是不同地區(qū)紅腐乳中的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群。
在屬水平下,9 個(gè)紅腐乳樣品共檢測(cè)出296 個(gè)細(xì)菌屬,圖3顯示相對(duì)豐度前12的物種。其中共有的菌屬分別為:棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、四聯(lián)球菌屬(Tetragenococcus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、Rummeliibacillus、乳球菌屬(Lactococcus)、魏斯氏菌屬(Weissella)、鏈球菌屬(Streptococcus)、叢毛單胞菌屬(Comamonas)、芽孢桿菌屬(Bacillus)以及Trabulsiella。
圖3 屬水平下紅腐乳樣品中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分布Fig. 3 Distribution of bacterial communities in red sufu samples at genus level
從群落結(jié)構(gòu)分布圖可以發(fā)現(xiàn)不同樣品中優(yōu)勢(shì)菌在種類及相對(duì)分布上有較大的差異。同一地區(qū)的樣品間細(xì)菌群落組成相似:R3、R5和R6樣品中優(yōu)勢(shì)屬為明串珠菌屬(29.45%、36.86%、30.72%)、乳球菌屬(9.59%、12.55%、20.72%)以及四聯(lián)球菌屬(8.75%、11.36%、12.05%);R4樣品在豐度上與上述樣品有所差異,分別對(duì)應(yīng)明串珠菌屬(13.33%)、乳球菌屬(10.81%)、四聯(lián)球菌屬(47.11%);而同樣來(lái)自華東地區(qū)的樣品R1,則展現(xiàn)了不同的細(xì)菌群落組成,相對(duì)豐度為22.83%的叢毛單胞菌屬是該樣品的優(yōu)勢(shì)菌屬,這個(gè)屬在其他樣品中的相對(duì)豐度均小于2%。叢毛單胞菌屬在1985年由De Vos等[26]建立,該屬中的菌株更多地與環(huán)境污染物的降解有關(guān)[27-28],在食品中鮮有報(bào)道。因此在食品發(fā)酵中對(duì)于該菌屬的認(rèn)識(shí)值得深入研究。
此外,樣品R5、R6中的魏斯氏菌屬(5.55%、4.03%)是相比于其他樣品所特有的菌屬。芽孢桿菌屬和鹽厭氧菌屬(Halanaerobium)主要出現(xiàn)在R7、R8和R9樣品中,芽孢桿菌屬為R7和R9的優(yōu)勢(shì)菌,相對(duì)豐度分別為58.08%和52.24%。華東地區(qū)的優(yōu)勢(shì)菌屬明串珠菌屬在R7、R8和R9中相對(duì)豐度較低,均低于5%。R8中棒狀桿菌屬(44.08%)是該樣品的優(yōu)勢(shì)菌屬。相比于其他樣品,R8中梭菌屬(Clostridium)相對(duì)豐度最高,達(dá)到7.12%。梭菌屬是能形成芽孢、厭氧生長(zhǎng)的革蘭氏染色陽(yáng)性大桿菌,可以分解糖、蛋白質(zhì),通常可以產(chǎn)生混合的有機(jī)酸和醇類,不還原硫酸鹽。它們的代謝物極富多樣性,廣泛分布在環(huán)境中,許多種可產(chǎn)生外毒素危害人類和牲畜生命健康[29]。
根據(jù)OTU的豐度數(shù)據(jù),熱圖可在屬水平上將不同的OTU分塊聚類,并根據(jù)顏色梯度以映不同樣品中細(xì)菌群落相似性、差異性及物種聚類關(guān)系。利用R語(yǔ)言繪制熱圖,可以直觀地顯示不同地區(qū)樣品中微生物的差異。由圖4可知,上側(cè)為樣品聚類樹(shù),左側(cè)為OTU聚類樹(shù),不同地區(qū)的9 種紅腐乳可分為3 個(gè)聚類:R7、R8和R9聚為一類,R3、R4、R5和R6聚為一類,R1和R2聚為一類,說(shuō)明不同樣品間細(xì)菌群落存在一定的差異性。
圖4 樣品中不同屬組成和相對(duì)豐度的熱圖Fig. 4 Heatmap of composition and relative abundance of different genera
圖5 不同地區(qū)腐乳樣品中細(xì)菌群落主成分分析Fig. 5 Principal coordinate analysis of bacterial communities in red sufu samples
基于UniFrac距離的加權(quán)主坐標(biāo)法對(duì)9 種紅腐乳細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。如圖5所示,細(xì)菌群落第1主成分(PC1)貢獻(xiàn)率為52.36%,第2主成分(PC2)貢獻(xiàn)率為22.77%。兩主成分之和大于70%,表明2 個(gè)成分較好地代表了樣品中的細(xì)菌群落信息。從圖5可知,不同腐乳樣本中的菌群與地理位置存在一定關(guān)系,同一地區(qū)的紅腐乳樣品具有一定的聚類趨勢(shì),這與熱圖樣品聚類結(jié)果相似:R3、R4、R5和R6聚為一類,均來(lái)源于華東地區(qū);樣品R7(東北)和R9(華北)聚為一類;R1(華東)、R2(華北)、R8(東北)3 個(gè)樣品較為離散,各自獨(dú)立。
腐乳是中國(guó)獨(dú)具特色的大豆發(fā)酵食品之一,大豆經(jīng)微生物發(fā)酵后所制成的一種干酪型產(chǎn)品[30]。通常根據(jù)其色澤風(fēng)味可分為白腐乳、紅腐乳、青(臭)腐乳三大類[31]。紅腐乳添加紅曲浸潤(rùn)數(shù)月后釀制而成,故表面呈自然紅色。腐乳風(fēng)味的形成主要取決于微生物的發(fā)酵,腐乳中微生物群落特征的差異是不同地區(qū)風(fēng)味不同的重要原因之一。有學(xué)者對(duì)紅腐乳中的紅曲霉進(jìn)行遺傳學(xué)比較,發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)的紅曲霉存在一定的遺傳差異性[32]。由于腐乳特殊的生產(chǎn)工藝以及未有加熱殺菌的過(guò)程,使得腐乳中微生物種類和數(shù)量受到廣大學(xué)者的關(guān)注。因此對(duì)腐乳中微生物菌群的分析研究有助于為產(chǎn)品質(zhì)量控制、挖掘潛在功能性微生物及風(fēng)味改良提供理論支持。目前對(duì)于腐乳中微生物菌群的研究主要分為培養(yǎng)法和非培養(yǎng)法兩種。利用傳統(tǒng)微生物分離培養(yǎng)法,紅腐乳中主要的優(yōu)勢(shì)菌種為蠟狀芽孢桿菌和Virgibacillus senegalensis[14];植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、乳桿菌Akporo7和嗜鹽乳桿菌[33]也被發(fā)現(xiàn)存在于腐乳中。周婷婷等[34]分析了不同品牌白腐乳樣品的蠟樣芽孢桿菌總數(shù),其中有2 個(gè)樣品的蠟樣芽孢桿菌數(shù)達(dá)到106CFU/g。Han等[31]對(duì)3 種類型腐乳中的不同微生物進(jìn)行了鑒定和計(jì)數(shù),發(fā)現(xiàn)腐乳中致病菌有蠟樣芽孢桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌。值得注意的是,由于樣品中存在大量的芽孢菌,干擾了金黃色葡萄球菌在選擇性平板上的生長(zhǎng),樣品中未能檢測(cè)到金黃色葡萄球菌,但在白腐乳和臭腐乳樣品中檢測(cè)到金黃色葡萄球菌腸毒素A??梢?jiàn),運(yùn)用純培養(yǎng)法對(duì)于腐乳中微生物菌群的認(rèn)識(shí)有一定的局限性。
利用PCR-變性梯度凝膠電泳技術(shù),比較不同品牌腐乳細(xì)菌多樣性,發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌屬是腐乳中細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌群[35]。耿予歡等[36]建立了不依賴純培養(yǎng)的腸桿菌基因間重復(fù)一致序列-PCR技術(shù),監(jiān)測(cè)了腐乳發(fā)酵過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)變化。上述兩種方法雖然彌補(bǔ)了傳統(tǒng)純培養(yǎng)法的缺陷,但是均依賴于電泳技術(shù),結(jié)果重現(xiàn)性相對(duì)較低。
高通量測(cè)序技術(shù)不僅能夠快速地分析復(fù)雜微生物群落多樣性,還能檢測(cè)到低存在率以及不可培養(yǎng)的微生物。劉亞棟[37]利用高通量測(cè)序分析菌屬發(fā)現(xiàn)同一品牌的紅、白和青腐乳之間細(xì)菌組成具有較大的差異性。Huang Xiaoning等[38]利用Illumina MiSeq高通量測(cè)序平臺(tái)發(fā)現(xiàn)腸桿菌屬、不動(dòng)桿菌屬、乳球菌屬是紅腐乳發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中的主要優(yōu)勢(shì)菌屬。
本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)不同地區(qū)紅腐乳中細(xì)菌多樣性進(jìn)行分析。從屬水平上菌群結(jié)構(gòu)分布可知,不同地區(qū)的腐乳中細(xì)菌的多樣性存在差異。華東地區(qū)的腐乳主要優(yōu)勢(shì)菌屬為明串珠菌屬、乳球菌屬以及四聯(lián)球菌屬;芽孢桿菌屬則是東北地區(qū)紅腐乳的主要優(yōu)勢(shì)菌屬;此外,魏斯氏菌屬、梭菌屬則分別是華東地區(qū)(江蘇?。?、東北地區(qū)(黑龍江?。┧赜械木鷮佟?/p>
對(duì)9 種紅腐乳細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行主成分分析,發(fā)現(xiàn)同一地區(qū)的紅腐乳樣品中菌群存在一定的聚類關(guān)系。目前,我國(guó)腐乳生產(chǎn)發(fā)酵依據(jù)豆腐坯培菌的菌種不同,可分為毛霉型、根霉型和細(xì)菌型[39],如R8樣品是采用藤黃微球菌(Micrococcus luteus)進(jìn)行發(fā)酵的細(xì)菌型腐乳,使得菌群結(jié)構(gòu)不同于其他東北地區(qū)的樣品,兩個(gè)東北地區(qū)樣品菌群結(jié)構(gòu)距離較遠(yuǎn)。由于腐乳的生產(chǎn)過(guò)程多為開(kāi)放式生產(chǎn),且多為傳統(tǒng)的手工操作,生產(chǎn)車(chē)間空氣、主要接觸面以及生產(chǎn)過(guò)程中的原輔料中的微生物均會(huì)對(duì)最終的產(chǎn)品產(chǎn)生影響[7],使得每個(gè)廠家的腐乳中微生物菌群具有一定的獨(dú)特性,這可能是R1樣品與其他華東地區(qū)樣品離散的原因;而R2樣品中還添加了玫瑰花作為輔料,玫瑰花中的微生物在后發(fā)酵過(guò)程中影響了該樣品的菌群結(jié)構(gòu)。
本研究通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)不同地區(qū)紅腐乳中細(xì)菌多樣性進(jìn)行分析,對(duì)其中優(yōu)勢(shì)菌群組成進(jìn)行了初步分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),本次測(cè)序深度有效地覆蓋了樣品中微生物種類,不同地區(qū)紅腐乳樣品中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)具有豐富多樣性。在門(mén)水平上,厚壁菌門(mén)、放線菌門(mén)和變形菌門(mén)為紅腐乳中主要的門(mén);而在屬水平上,不同地區(qū)紅腐乳樣品中優(yōu)勢(shì)菌在種類及相對(duì)分布上有較大的差異,明串珠菌屬、乳球菌屬以及四聯(lián)球菌屬為華北地區(qū)樣品中主要的優(yōu)勢(shì)菌屬,而東北地區(qū)腐乳樣品中的芽孢桿菌屬和鹽厭氧菌屬為主要的優(yōu)勢(shì)菌屬。