王大慧，徐若烊，黎德超，衛(wèi)功元

（蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，江蘇 蘇州 215123）

S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM）和谷胱甘肽（glutathione，GSH）均為廣泛存在于細(xì)胞內(nèi)的重要活性含硫小分子化合物，在生物體內(nèi)發(fā)揮重要的生理功能。SAM具有轉(zhuǎn)甲基、轉(zhuǎn)氨丙基、轉(zhuǎn)硫基等作用，參與體內(nèi)基因調(diào)控、神經(jīng)傳導(dǎo)以及解毒等多種生理過程[1-2]，GSH具有提高機體免疫力和抗氧化等功能，在臨床醫(yī)藥、運動保健和食品加工等領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用前景[3-4]。

酵母發(fā)酵法是合成SAM和GSH最常用的方法[5-6]。在酵母細(xì)胞中，SAM由L-甲硫氨酸和ATP經(jīng)SAM合成酶催化合成[7]；而GSH由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸經(jīng)γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-glutamylcysteine synthetase，γ-GCS）和谷胱甘肽合成酶催化的序貫以應(yīng)合成[8]。同時，SAM和GSH的生物合成均需要ATP參與，胞內(nèi)ATP的供給水平是決定SAM和GSH能否過量合成的重要因素[9]。本實驗組分別通過誘變育種[10]、添加前體氨基酸[11]和能量輔助物質(zhì)[12]、過量表達外源基因[13]和敲除線粒體膜相關(guān)基因[14]，提高了胞內(nèi)SAM和GSH的含量，實現(xiàn)了分批發(fā)酵過程中SAM和GSH的聯(lián)合高產(chǎn)。SAM和GSH均屬于胞內(nèi)物質(zhì)，細(xì)胞密度的增加將有助于二者聯(lián)產(chǎn)產(chǎn)量的提高。因此，有必要考察高密度培養(yǎng)條件下的SAM和GSH生物合成情況及其影響因素。

在食品發(fā)酵工業(yè)中，許多微生物在代謝過程中會遭遇到酸脅迫環(huán)境，對酸脅迫也有一定的抵抗和適應(yīng)能力[15-16]。不同微生物對外界酸脅迫環(huán)境的響應(yīng)情況不盡相同，導(dǎo)致不同代謝產(chǎn)物在生物合成中所需的最適pH值也會有很大的差異[17]。近年來，隨著微生物抗逆性相關(guān)的生理機制被逐漸解析，酸脅迫處理也開始應(yīng)用于微生物代謝產(chǎn)物的過量合成[18]。在以往針對產(chǎn)朊假絲酵母分批發(fā)酵的研究中，發(fā)現(xiàn)pH 5.0有利于細(xì)胞生長和SAM合成[19]，弱酸脅迫（pH 3.5）有助于胞內(nèi)GSH含量的提升[20]，而強酸脅迫（pH 1.5）則明顯抑制了細(xì)胞的正常代謝[21]。然而，目前還不清楚酸脅迫對高密度培養(yǎng)條件下的產(chǎn)朊假絲酵母生物合成SAM和GSH過程將產(chǎn)生的影響。為此，本研究比較不同pH值條件下的產(chǎn)朊假絲酵母高密度培養(yǎng)過程，重點考察酸脅迫環(huán)境對酵母細(xì)胞合成SAM和GSH能力的影響，并對酸脅迫的作用機制進行解析，以期為深入理解產(chǎn)朊假絲酵母生理特性以及提高SAM和GSH生物合成能力拓展思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

產(chǎn)朊假絲酵母（Candida utilis Δpor1），由蘇州大學(xué)微生物生理與代謝調(diào)控研究室篩選并保藏[14]。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，酵母粉10 g/L，蛋白胨10 g/L；pH 6.0。發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖35 g/L，(NH4)2SO410 g/L，KH2PO412.3 g/L，L-甲硫氨酸4.6 g/L，CaCl20.05 g/L，MgSO40.05 g/L；pH值根據(jù)實驗要求確定。流加培養(yǎng)基：葡萄糖600 g/L，(NH4)2SO4100 g/L，KH2PO4123 g/L，L-甲硫氨酸46 g/L，CaCl20.5 g/L，MgSO40.5 g/L；葡萄糖單獨滅菌后與其他成分混合。

1.2 儀器與設(shè)備

1525型高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀 美國Waters公司；BIOTECH-5BGZ攪拌式發(fā)酵罐 上海保興生物設(shè)備工程有限公司；HZ-2010KA恒溫?fù)u瓶柜 太倉市華利達實驗儀器設(shè)備有限公司；J6-MI型冷凍離心機 美國Beckman公司；UV2300 II雙光束紫外-可見分光光度計 上海天美科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 種子培養(yǎng)

將在-70 ℃超低溫冰箱中保藏的菌種（1 mL）接種至裝有50 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，于30 ℃、200 r/min搖床中培養(yǎng)24 h。

1.3.2 高密度培養(yǎng)

將種子液接種到裝有3 L發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，接種量10%（V/V），起始轉(zhuǎn)速350 r/min，通氣量3.0 L/min。為實現(xiàn)高密度培養(yǎng)，自第12小時起以多項式流加方式補加流加培養(yǎng)基至總糖質(zhì)量濃度為200 g/L（至約28 h），具體流加操作方法見文獻[22]。通過手動調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速（300～900 r/min）將溶氧水平控制在不低于30%。pH值采用梅特勒電極在位監(jiān)測，并通過流加3 mol/L H2SO4溶液或3 mol/L NaOH溶液將pH值控制在實驗要求的范圍內(nèi)。

1.3.3 無細(xì)胞提取物的制備

取5 mL發(fā)酵液，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，得到的酵母細(xì)胞經(jīng)生理鹽水洗滌2 次后，再重新懸浮在5 mL 0.2 mol/L磷酸緩沖溶液（pH 7.0）中，超聲破碎10 min（破碎10 s，間隔10 s），4 ℃、12 000 r/min離心20 min，收集上清液（即無細(xì)胞提取物），用于測定胞內(nèi)物質(zhì)的質(zhì)量濃度和關(guān)鍵酶活性。

1.3.4 指標(biāo)測定

細(xì)胞干質(zhì)量和葡萄糖質(zhì)量濃度的測定參考文獻[4]。

胞內(nèi)SAM的提取和測定[10]：取10 mL新鮮發(fā)酵液，3 500 r/min離心10 min，濕細(xì)胞用0.35 mol/L稀硫酸溶液萃取2 h，離心，上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，獲得的樣品采用HPLC法測定SAM質(zhì)量濃度。

GSH的提取和測定[23]：取10 mL新鮮發(fā)酵液，3 500 r/min離心10 min，濕細(xì)胞在30 ℃用體積分?jǐn)?shù)40%乙醇溶液萃取2 h，離心，取上清液采用DTNB-谷胱甘肽還原酶循環(huán)法定量測定GSH質(zhì)量濃度。

胞內(nèi)NADH、NAD+、ATP和ADP質(zhì)量濃度的測定采用HPLC法[11]。

1.3.5 酶活性測定

SAM合成酶（蛋氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶（methionine adenosyltransferase，MAT））活性的測定方法參見文獻[12]。

γ-GCS、己糖激酶（hexose kinase，HK）、ATP合成酶、過氧化氫酶（catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的活性以及丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量均采用南京建成生物科技有限公司的相關(guān)試劑盒進行測定，具體操作步驟參照試劑盒說明書執(zhí)行。

異檸檬酸脫氫酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）活性采用上海酶聯(lián)生物科技有限公司的試劑盒進行測定，具體操作步驟參照試劑盒說明書執(zhí)行。

1.3.6 發(fā)酵過程參數(shù)計算

胞內(nèi)SAM和GSH含量、細(xì)胞得率、SAM和GSH得率、細(xì)胞生產(chǎn)強度、SAM和GSH生產(chǎn)強度等發(fā)酵過程參數(shù)的計算方法見文獻[14]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有實驗數(shù)據(jù)均以3 組平行樣品檢測結(jié)果的 ±s表示，差異顯著性檢驗以pH 5.0組作為對照組，用t檢驗雙尾檢驗分析。Excel 2010軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同pH值條件下的SAM和GSH聯(lián)產(chǎn)發(fā)酵過程分析

圖1 不同pH值條件下的SAM和GSH聯(lián)產(chǎn)發(fā)酵過程Fig. 1 Time courses of high cell culture for the co-production of SAM and GSH under different pH conditions

在前期分批發(fā)酵研究[18-21]的基礎(chǔ)上，重點考察酸脅迫環(huán)境對高密度培養(yǎng)條件下產(chǎn)朊假絲酵母生物合成SAM和GSH的影響。為此，將發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值分別控制在2.5（強酸脅迫）、3.5（弱酸脅迫），并以pH 5.0（適合生長）作為對照。不同pH值條件下的葡萄糖消耗、細(xì)胞生長、SAM和GSH合成情況見圖1，SAM和GSH產(chǎn)量、含量、得率和生產(chǎn)強度等發(fā)酵過程參數(shù)的最大值見表1?？梢钥闯?，酵母細(xì)胞能在較寬的pH值范圍內(nèi)利用葡萄糖進行生長并達到較高的細(xì)胞密度，但是在pH 2.5和pH 3.5條件下的最大細(xì)胞干質(zhì)量分別比pH 5.0時的水平下降10.1%和8.1%。綜合細(xì)胞得率和生產(chǎn)強度等過程參數(shù)的結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，酵母細(xì)胞在酸脅迫環(huán)境下的生長代謝明顯受到了一定程度的抑制。

表1 不同pH值條件下的SAM和GSH聯(lián)產(chǎn)發(fā)酵過程參數(shù)Table 1 Parameters involved in high cell culture for the co-production of SAM and GSH under different pH conditions

與細(xì)胞生長情況不同，pH 3.5有利于SAM和GSH的生物合成（圖1），胞內(nèi)SAM和GSH含量分別比pH 5.0時的結(jié)果高出17.1%和20.9%，最終SAM和GSH聯(lián)產(chǎn)量也提高了10.4%。表1中SAM、GSH得率和生產(chǎn)強度等結(jié)果也證明了pH 3.5可以促進SAM和GSH在酵母細(xì)胞內(nèi)的合成和積累。然而，在pH 2.5條件下，酵母細(xì)胞的SAM和GSH合成能力明顯下降，SAM和GSH的聯(lián)產(chǎn)量、得率、生產(chǎn)強度等指標(biāo)均低于pH 5.0條件下的結(jié)果。由此可見，弱酸脅迫可以提高SAM和GSH的合成能力，而強酸脅迫則對酵母細(xì)胞的代謝過程產(chǎn)生了不利的影響。以下將對酸脅迫在高密度聯(lián)產(chǎn)發(fā)酵中的作用機制進行解析。

2.2 SAM和GSH合成關(guān)鍵酶活性

MAT和γ-GCS分別是SAM和GSH生物合成途徑中的關(guān)鍵酶[7-8]，圖2結(jié)果表明，在同一pH值條件下，細(xì)胞生長期間（前36 h）的MAT活性均維持在相對穩(wěn)定的水平，而在高密度培養(yǎng)后期（48、60 h）MAT的活性有所提高，但幅度不大。與此同時，γ-GCS活性在細(xì)胞生長期逐漸增加，至36 h達到最大值，之后逐漸降低。圖2還表明，在任一培養(yǎng)階段，pH 3.5時的MAT和γ-GCS活性均高于pH 2.5和pH 5.0時的活性，表明弱酸脅迫環(huán)境有利于將SAM和GSH生物合成關(guān)鍵酶的活性維持在較高水平。

圖2 不同pH值條件下的MAT和γ-GCS活性Fig. 2 Activities of MAT and γ-GCS under different pH conditions

2.3 能量代謝物質(zhì)合成關(guān)鍵酶活性

HK和IDH分別是糖酵解途徑和三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵酶之一，在好氧發(fā)酵中，其活性的大小對胞內(nèi)葡萄糖消耗和NADH形成速率均能產(chǎn)生重要的影響[9]。由圖3可以看出，不同pH值環(huán)境下的酵母胞內(nèi)HK活性均在18 h達到較高的水平，此時pH 3.5和pH 5.0條件下的HK活性相差不大。此外，在葡萄糖流加期間，IDH基本不受pH值環(huán)境和培養(yǎng)時間的影響，其活性一直維持在較為穩(wěn)定的水平；至第30小時，IDH活性雖然有所提高，但不同pH值條件下的結(jié)果沒有明顯差異。綜合30 h前的HK和IDH活性結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，pH 3.5和pH 5.0環(huán)境比pH 2.5更加有利于底物的消耗，并促進NADH的合成與供給。

為研究酵母胞內(nèi)ATP的合成是否受pH值的影響，檢測不同培養(yǎng)階段ATP合成酶的活性，結(jié)果如圖4所示?？梢钥闯觯琾H 2.5條件下的ATP合成酶活性一直維持在較低水平，且不同培養(yǎng)時間下的酶活性沒有明顯差異，而在pH 3.5和pH 5.0時，流加結(jié)束后的ATP合成酶活性均明顯提高，其中pH 3.5更有利于將ATP合成酶活性提高到較高水平。因此，在NADH供給充足的前提下，細(xì)胞在pH 3.5條件下可以合成更多ATP，以滿足生長和代謝的需要。

圖3 不同pH值條件下的HK和IDH活性Fig. 3 Activities of HK and IDH under different pH conditions

圖4 不同pH值條件下的ATP合成酶活性Fig. 4 Activity of ATP synthase under different pH conditions

2.4 胞內(nèi)能量代謝物質(zhì)水平及比率

圖5 不同pH值條件下的胞內(nèi)能量代謝物質(zhì)含量及比率Fig. 5 Intracellular levels and ratios of energy metabolism substances under different pH conditions

為了考察pH值對酵母能量代謝的影響，對胞內(nèi)與能量代謝有關(guān)的輔因子物質(zhì)（NADH、NAD+、ATP和ADP）含量進行測定。圖5結(jié)果表明，不同pH值條件下的胞內(nèi)NADH和ATP含量均在第30小時達到最高水平，且pH 3.5比pH 2.5和pH 5.0的水平更高。與此同時，NADH/NAD+和ATP/ADP比率在30 h后均處于較為穩(wěn)定的水平，其中pH 3.5時的比率更高，體現(xiàn)出弱酸脅迫環(huán)境下NADH和ATP具有更強的再生能力，為胞內(nèi)能量物質(zhì)的充足供給提供有力保障。

2.5 胞內(nèi)氧化還原環(huán)境

圖6 不同pH值條件下的CAT和SOD活性Fig. 6 Activities of CAT and SOD under different pH conditions

圖7 不同pH值條件下的胞內(nèi)MDA含量Fig. 7 Intracellular contents of MDA under different pH conditions

為考察pH值對酵母胞內(nèi)氧化還原環(huán)境的影響，測定CAT、SOD活性以及MDA含量，結(jié)果見圖6、7?？梢园l(fā)現(xiàn)，當(dāng)pH 2.5時的不同培養(yǎng)時間下CAT、SOD活性和MDA含量與對照（pH 5.0）相比沒有顯著差異；而pH 3.5時的CAT活性明顯高于對照，SOD活性變化不大，而胞內(nèi)MDA含量則相應(yīng)下降。以上結(jié)果表明，弱酸脅迫有利于CAT活性的提高，同時也有助于保護細(xì)胞和細(xì)胞膜免受氧化應(yīng)激損傷。

3 討 論

酸脅迫常見于食品發(fā)酵工業(yè)中。一般認(rèn)為，環(huán)境中較低的pH值將促使H+通過細(xì)胞膜滲漏進入胞內(nèi)，導(dǎo)致微生物胞內(nèi)pH值下降，進而影響胞內(nèi)的一系列生化以應(yīng)和細(xì)胞的正常生長與代謝[17,24]。為適應(yīng)酸脅迫環(huán)境，維持胞內(nèi)pH值的相對穩(wěn)定，微生物細(xì)胞已經(jīng)進化出多種調(diào)節(jié)機制，主要包括：消耗ATP將H+泵出胞外[25]、通過激活特定酶系消耗胞內(nèi)的H+[26]、誘導(dǎo)細(xì)胞合成伴侶蛋白以修復(fù)損傷[27]、改變細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)以保護細(xì)胞免受傷害[28]等。此外，有研究結(jié)果表明，GSH在微生物抵抗酸脅迫過程中也具有積極作用，GSH可以通過作為“自殺式”消耗的底物阻止胞內(nèi)pH值的快速下降[29-30]。本研究利用GSH的這種生理特性，通過對產(chǎn)朊假絲酵母進行弱酸脅迫處理，實現(xiàn)了高密度培養(yǎng)條件下的GSH過量合成，酵母細(xì)胞的SAM合成能力也有明顯提高。在此基礎(chǔ)上，對弱酸脅迫在SAM和GSH聯(lián)合高產(chǎn)中的作用及其生理機制進行了解析。

在酵母細(xì)胞內(nèi)，SAM和GSH均屬于甲硫氨酸代謝途徑中的關(guān)鍵節(jié)點物質(zhì)[31]。在甲硫氨酸供給充足的前提下，關(guān)鍵酶MAT和γ-GCS活性的提高將有利于SAM和GSH的過量合成。本研究結(jié)果表明，強酸脅迫條件下的MAT和γ-GCS活性均受到部分抑制，而弱酸脅迫則有助于將關(guān)鍵酶活性維持在更高的水平。因此，弱酸脅迫提高了產(chǎn)朊假絲酵母合成SAM和GSH的能力，從而進一步提升了高密度培養(yǎng)下SAM和GSH的聯(lián)產(chǎn)量。

除物質(zhì)代謝以外，能量代謝物質(zhì)ATP的供給與消耗也是決定SAM和GSH能否過量合成的重要因素[13]。產(chǎn)朊假絲酵母利用葡萄糖進行好氧生長和代謝時，中心代謝途徑中HK和IDH以及ATP合成酶的活性將影響到葡萄糖的消耗、NADH和ATP的形成[9]。通過對不同pH值條件下HK和IDH活性進行比較，發(fā)現(xiàn)弱酸脅迫雖然對IDH活性影響不大，但提高了HK活性，加速了葡萄糖的利用，有利于NADH的形成。同時，ATP合成酶活性在弱酸脅迫條件下也有明顯的提高，從而加快了從NADH到ATP代謝的進程。結(jié)合胞內(nèi)NADH和ATP水平、NADH/NAD+和ATP/ADP比率結(jié)果可以得出，弱酸脅迫促進了能量代謝物質(zhì)的合成和再生，為SAM和GSH過量合成所需ATP提供了充足的保障。

微生物細(xì)胞在遭遇脅迫環(huán)境時，容易產(chǎn)生自由基而影響到胞內(nèi)氧化還原環(huán)境[32-33]。胞內(nèi)消除自由基損傷的機制主要包括具有抗氧化能力的酶類和還原性物質(zhì)[34]。本研究的CAT和SOD活性結(jié)果表明，產(chǎn)朊假絲酵母抵抗弱酸脅迫可能主要依賴于CAT活性的提高，而在強酸脅迫條件下的抵抗機制應(yīng)該更多地來自于還原性物質(zhì)的保護。MDA是生物體內(nèi)脂質(zhì)與自由基發(fā)生過氧化以應(yīng)的產(chǎn)物，其含量的高低通常體現(xiàn)出細(xì)胞膜脂質(zhì)的過氧化程度和細(xì)胞損傷程度[35]。本研究弱酸脅迫下的MDA含量低于強酸脅迫和pH 5.0時的結(jié)果，表明該條件下的胞內(nèi)氧化還原環(huán)境更加有利于細(xì)胞維持正常的結(jié)構(gòu)和功能，這一方面得益于胞內(nèi)更高的CAT活性，另一方面也要歸功于胞內(nèi)更高的GSH含量。

綜上，本實驗考察并比較了不同pH值條件下的產(chǎn)朊假絲酵母高密度培養(yǎng)過程，發(fā)現(xiàn)弱酸脅迫有利于提升SAM和GSH的合成能力，進而提高了SAM和GSH的聯(lián)產(chǎn)量。在分析發(fā)酵動力學(xué)參數(shù)的基礎(chǔ)上，結(jié)合SAM和GSH生物合成關(guān)鍵酶活性、能量代謝物質(zhì)的水平與比率，以及胞內(nèi)氧化還原水平，部分解析了弱酸脅迫促進SAM和GSH聯(lián)合高產(chǎn)的生理機制。研究結(jié)果有助于深入理解酵母細(xì)胞響應(yīng)酸脅迫的生理機制，同時也為提高SAM和GSH聯(lián)產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)量提供了一種可行的思路。