楊大俏,王錦旭,李來好,楊賢慶,馬海霞,岑劍偉,王悅齊
(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品加工重點實驗室,廣東 廣州 510300;2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 201306;3.韓山師范學(xué)院食品工程與生物科技學(xué)院,廣東 潮州 521041)
近江牡蠣(Crassostrea rivularis)是瓣鰓綱牡蠣目牡蠣科海洋雙殼類軟體動物,是我國四大養(yǎng)殖貝類之一,在廣東、廣西、福建、山東、浙江等沿海地區(qū)有大量人工養(yǎng)殖[1]。其肉質(zhì)鮮美,營養(yǎng)豐富,含有豐富的蛋白質(zhì)[2]和碳水化合物,因其鋅含量極高,富含鐵、鈣等元素,素有“海洋牛奶”[3]的稱號,中醫(yī)學(xué)認(rèn)為,牡蠣重鎮(zhèn)安神,滋陽補(bǔ)陰,軟堅散結(jié),收斂固澀,對驚悸失眠、勞神傷脾、陽痿、腰痛、崩漏等癥有一定療效。
多糖是由10 個以上單糖通過糖苷鍵聯(lián)結(jié)在一起的大分子,廣泛存在于動物、植物、微生物和真菌中,具有提高機(jī)體免疫力[4]、抗腫瘤[5-6]、抗氧化[7]、抗病毒[8]、抗衰老[9]等生物活性。前人對牡蠣多糖的研究集中于牡蠣多糖的提取、活性研究及簡單結(jié)構(gòu)分析,結(jié)果表明,太平洋牡蠣多糖主要由葡萄糖[10]組成,是以→4)-α-D-Glc-(1→為主鏈,含→3,4)-β-DGlc-(1→)支鏈的D-吡喃型葡聚糖,分子質(zhì)量為1 299 kDa[11]。另外針對近江牡蠣多糖提取工藝及活性研究,結(jié)果表明,水提醇沉法制備粗多糖得率達(dá)9.72%[12],近江牡蠣多糖具有增強(qiáng)免疫功能[13]及抗腫瘤[14]的活性。目前有關(guān)近江牡蠣多糖的結(jié)構(gòu)分析及活性研究較少,且多集中于粗多糖的體外抗氧化實驗[15-16],關(guān)于近江牡蠣多糖的超濾膜分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定及純化多糖的免疫調(diào)節(jié)還鮮有報道。為高值化利用近江牡蠣資源,本課題對近江牡蠣粗多糖進(jìn)行純化,得到3 種近江牡蠣純化多糖。采用液相色譜分析法、傅里葉變換紅外光譜法、高碘酸氧化法及Smith降解法研究近江牡蠣多糖的結(jié)構(gòu);噻唑蘭法、中性紅實驗、利用試劑盒檢測細(xì)胞因子的分泌及mRNA的表達(dá),用于研究近江牡蠣多糖的免疫調(diào)節(jié)能力。以期為近江牡蠣多糖生物活性作用機(jī)制與分子結(jié)構(gòu)間的關(guān)系和近江牡蠣多糖的應(yīng)用提供有用信息和數(shù)據(jù)支持。
近江牡蠣全臟器(-20 ℃冷凍保藏) 廣東省臺山市農(nóng)貿(mào)市場;Alcalase酶(210 AU/mg)、胰蛋白酶(≥250 U/mg) 廣州齊云生物技術(shù)有限公司;離子交換填料DEAE纖維素DE-52、Sephadex G-100葡聚糖凝膠 北京Biotopped科技有限公司;1,9-二甲基亞甲基藍(lán)、葡聚糖、氨基葡萄糖、11 種單糖、D-葡萄糖醛酸等標(biāo)準(zhǔn)品、磷酸緩沖液、DMEM高糖培養(yǎng)基溶液、胰蛋白酶、胎牛血清、鏈霉素、青霉素、脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、噻唑蘭 美國Sigma公司;乙腈(色譜純) 上海安譜實驗科技股份有限公司;小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7 中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心;中性紅、腫瘤壞死因子TNF-α、白介素IL-6、白介素IL-1βELISA試劑盒、一氧化氮檢測試劑盒、FastStart Universal SYBR Green Master試劑盒、Transcriptor cDNA Synth Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、6 孔/96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板、透氣細(xì)胞培養(yǎng)瓶、無菌離心管華宇欣生物科技有限公司;其他試劑均為分析純。
Sunrise-basic Tacan吸光酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司;FlowMem0021-HP三聯(lián)高壓平板膜設(shè)備 廈門福美科技有限公司;LC-20AD高效液相色譜儀、IRAffinity-1紅外光譜儀、GC-2010氣相色譜儀 日本島津公司;S1000聚合酶鏈?zhǔn)揭詰?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)儀美國Bio-Rad公司;Mastercycler realplex實時熒光定量PCR儀 德國Eppendorf公司;NanoDrop 2000超微量紫外分光光度計 美國Thermo公司。
1.3.1 近江牡蠣多糖的制備與純化過程
近江牡蠣全臟器→勻漿→均質(zhì)10 min→熱水浸提→調(diào)pH 8.0→酶解→煮沸滅酶→離心(9 000 r/min,10 min)→上清液調(diào)pH 7.0→0.22 μm濾膜除雜→200 kDa膜分離→收集濾過液→濾過液經(jīng)8 kDa膜分離[17]→收集8 kDa截留液→凍干得粗多糖CRRS-B[18]→樣品溶解→DEAE-52陰離子交換柱層析→蒸餾水洗脫→收集組分→乙酸鈉洗脫→收集組分→氯化鈉洗脫→收集組分→透析→冷凍干燥→得近江牡蠣純化多糖CRP-1、CRP-2、CRP-3。
1.3.2 近江牡蠣多糖分子質(zhì)量和純度測定
采用高效凝膠滲透色譜法[19]測定近江牡蠣多糖組分CRRS-B的分子質(zhì)量分布,流動相為0.2 mol/L硫酸鈉溶液,檢測器為示差折光檢測器,柱溫30 ℃,進(jìn)樣體積20 μL,流速0.7 mL/min,色譜柱為Tosoh Biosep?G4000SWXL(7.8 mm×300 mm,5 μm),分別用流動相配制成質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的不同分子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液:平均分子質(zhì)量為1 000、5 000、10 000、50 000、150 000、410 000、670 000 Da的葡聚糖按照一定比例混合后,多糖樣品配制為0.5 mg/mL,用孔徑為0.22 μm微孔濾膜過濾后進(jìn)高效液相色譜儀,用峰面積歸一法計算粗多糖分子質(zhì)量的分布情況。
將凍干后的多糖樣品CRRS-B以蒸餾水溶解配制成10 mg/mL,上DEAE-52纖維素柱,分別以蒸餾水、0.1 mol/L乙酸鈉、0.5 mol/L乙酸鈉、0.01 mol/L氯化鈉、0.1 mol/L氯化鈉、1 mol/L氯化鈉梯度洗脫,以苯酚-硫酸法[20]測定洗脫溶液吸光度,收集洗脫組分,將各洗脫組分透析除鹽。將各洗脫組分分別上Sephadex G-100葡聚糖凝膠柱,以蒸餾水洗脫,繪制洗脫曲線。
1.3.3 近江牡蠣多糖理化性質(zhì)測定
采用苯酚-硫酸法測定純化多糖(CRP-1、CRP-2及CRP-3)中總糖含量;采用1,9-二甲基亞甲基藍(lán)[21]測定純化多糖中酸性糖含量;采用尹珊珊等[22]的方法測定甲基戊糖含量;采用硫酸-咔唑法[23]測定己糖醛酸含量;采用明膠-氯化鋇比濁法[24-25]測定硫酸基含量;采用Wanger法[26]測定氨基己糖含量。
1.3.4 近江牡蠣多糖單糖組成分析
樣品水解及標(biāo)準(zhǔn)品的衍生化方法參照陳燕文等[27]的方法,采用液相色譜法測定樣品中多糖組成。液相色譜條件:Gracesmart C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相A為100 mmol/L磷酸鈉緩沖溶液,流動相B為乙腈;檢測波長250 nm;柱溫30 ℃;流速1 mL/min;進(jìn)樣量5 μL;程序洗脫:0~10 min,85% A;10~30 min,85%~83% A;30~35 min,8 3%~8 0% A;35~36 min,80%~60% A;36~40 min,60%~85% A。
1.3.5 近江牡蠣多糖傅里葉變換紅外光譜分析
多糖樣品2 mg與100 mg溴化鉀混合研細(xì)后,在4 000~400 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)進(jìn)行傅里葉變換紅外光譜掃描[19]。
1.3.6 高碘酸氧化和Smith降解
參照文獻(xiàn)[28]的方法,記錄高碘酸鈉消耗量、甲酸生成量,將經(jīng)過高碘酸氧化及Smith降解的溶液水解、乙?;罄脷庀嗌V及Rtx-1701毛細(xì)管柱(30 m×0.32 mm,0.25 μm)進(jìn)行醇類化合物定性測定。
1.3.7 近江牡蠣多糖對小鼠巨噬細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)活性的測定
利用噻唑蘭法[29-30]檢測近江牡蠣多糖對小鼠巨噬細(xì)胞存活率的影響;中性紅實驗[30-31]檢測近江牡蠣多糖對小鼠巨噬細(xì)胞吞噬活性的影響;利用試劑盒檢測近江牡蠣多糖對小鼠巨噬細(xì)胞一氧化氮及細(xì)胞因子(TNF-α、IL-6和IL-1β)的影響;利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒檢測近江牡蠣多糖對巨噬細(xì)胞mRNA表達(dá)的影響。
以上實驗均經(jīng)過3 次重復(fù)操作,數(shù)值以 ±s表示。采用IBM SPSS Statistics 20.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析,運(yùn)用單因素方差分析其顯著性。
圖1 不同分子質(zhì)量葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品擬合曲線(a)及近江牡蠣多糖的分子質(zhì)量分布(b)Fig. 1 Fitting curve of glucan standards with different molecular masses (a) and molecular mass distribution of polysaccharides (b) from C. rivularis
由圖1可知,近江牡蠣粗多糖經(jīng)過凝膠滲透色譜分析得3 個峰的分子質(zhì)量分別為124.5、67.0 kDa和8.3 kDa,使用DEAE-52將其分離,依次使用蒸餾水、0.1 mol/L乙酸鈉、0.5 mol/L乙酸鈉、0.01 mol/L氯化鈉、0.1 mol/L氯化鈉、1 mol/L氯化鈉洗脫,結(jié)果見圖2。得到水洗組分CRP-1,0.5 mol/L乙酸鈉洗組分CRP-2,0.01 mol/L氯化鈉洗組分CRP-3。由圖3可知,3 種組分分別經(jīng)Sephadex G-100檢驗得到對稱的洗脫曲線,與高效凝膠滲透色譜法相互驗證,表明近江牡蠣純化多糖CRP-1、CRP-2、CRP-3為純度較好的分子質(zhì)量分別為124.5、67.0 kDa和8.3 kDa的單一組分多糖。
圖2 近江牡蠣多糖的梯度洗脫曲線Fig. 2 Gradient elution curve of polysaccharides from C. rivularis by DEAE-52 column chromatography
圖3 CRP-1~3的Sephadex G-100的洗脫曲線Fig. 3 Elution curves of CRP-1-3 by Sephadex G-100 column chromatography
苯酚-硫酸法測得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=7.468 2x-0.004 7,R2=0.999 0,測得CRP-1、CRP-2、CRP-3的總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為(32.40±0.89)%、(78.50±1.90)%、(73.46±2.19)%。1,9-二甲基亞甲基藍(lán)法測得酸性糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=1.257 8x+0.002 2,R2=0.999 0,測得結(jié)果中顯示CRP-1、CRP-2、CRP-3的酸性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為(0.28±0.01)%、(2.12±0.36)%、(2.74±0.46)%。采用文獻(xiàn)[22]的方法測得甲基戊糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.150 8x+0.215 1,R2=0.999 6,其質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0%、(9.36±0.62)%、(7.55±0.22)%。硫酸-咔唑法測得己糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.007 5x+0.096 9,R2=0.999 3,測得結(jié)果顯示CRP-1、CRP-2、CRP-3的己糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為(2.29±0.11)%、(16.14±0.63)%、(23.85±0.51)%。明膠-氯化鋇比濁法測得硫酸基標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.473 8x+0.025 5,R2=0.990 9,測得其質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為(1.60±0.08)%、(26.50±1.67)%、(27.02±3.39)%。Wanger法測得氨基己糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.035 2x-0.001,R2=0.990 8,測得CRP-1、CRP-2、CRP-3的氨基己糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為(18.62±0.55)%、(71.65±9.49)%、(41.04±7.17)%。
圖4 單糖標(biāo)準(zhǔn)品和CRP-1~3的單糖高效液相色譜圖Fig. 4 High performance liquid chromatograms of standard monosaccharides and monosaccharides derived from CRP-1 through 3
通過對多糖水解及其衍生化產(chǎn)物的測定,可以得出單糖組成和物質(zhì)的量比。多糖經(jīng)水解、衍生化,液相色譜測定,與標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時間相互對比,即可得到樣品中的單糖組成和物質(zhì)的量比。如圖4所示,與標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖對比可知,近江牡蠣多糖CRP-1主要由甘露糖、核糖、氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、氨基半乳糖、半乳糖、阿拉伯糖組成,9 種單糖的物質(zhì)的量比為5.55∶0.32∶9.08∶0.47∶0.66:48.13∶3.57∶8.53∶0.30,其中葡萄糖、氨基葡萄糖、半乳糖、甘露糖、氨基半乳糖含量之和達(dá)74.86%,葡萄糖含量最高。CRP-2主要由甘露糖、核糖、氨基葡萄糖、葡萄糖、氨基半乳糖、半乳糖組成,6 種單糖的物質(zhì)的量比為7.79∶0.41∶12.69∶32.08∶4.98∶15.92,葡萄糖、半乳糖、氨基葡萄糖、甘露糖、氨基半乳糖的含量之和達(dá)73.87%,其中氨基葡萄糖及氨基半乳糖含量高達(dá)17.67%。CRP-3主要由氨基葡萄糖、半乳糖醛酸、葡萄糖組成,3 種單糖的物質(zhì)的量比為8.91∶5.71∶10.15,醛酸所占比例達(dá)到23.05%。
圖5 CRP-1~3的傅里葉變換紅外光譜圖Fig. 5 Fourier transform infrared spectra of CRP-1 through 3
從圖5a可以看出,3 442.94 cm-1的強(qiáng)吸收峰為—OH鍵的伸縮振動吸收,2 958.8 cm-1為—CH3基團(tuán)的以對稱伸縮振動,2 924.09 cm-1出現(xiàn)C—H強(qiáng)伸縮振動峰,2 852.72 cm-1的—CH2的對稱伸縮振動峰,2 360.87 cm-1為C—H彎曲振動,其中,3 442.94 cm-1及2 924.09 cm-1為糖類化合物的特征峰。1 641.42 cm-1為—CHO的C=O的伸縮振動,1 458.18 cm-1為—CH3基團(tuán)的以對稱彎曲振動峰,1 413.82 cm-1為C—O對稱振動,10 31.92 cm-1為吡喃糖環(huán)的C=O伸縮振動。表明CRP-1為多醛基吡喃環(huán)糖苷的多糖化合物。
從圖5b可以看出,3 439.08 cm-1為—OH鍵的強(qiáng)伸縮振動,3 290.56 cm-1為—NH2的以對稱伸縮振動峰,3 184.48 cm-1為—OH與—COOH的二聚體OH的伸縮振動,2 983.88 cm-1為芳環(huán)與不飽和碳的伸縮振動,2 362.80 cm-1為—CH彎曲振動,1 400~1 200 cm-1的吸收峰為C—H的變角振動吸收峰,其中,3 439.08 cm-1及C—H變角振動峰為糖類化合物的特征峰。1 701.22 cm-1的吸收峰為酮基的C=O鍵的伸縮振動峰,1 683.86 cm-1處的吸收峰為—CH2—CO—NH—等酰胺的C=O伸縮振動峰,1 641.42 cm-1是順式或乙烯基的C=C伸縮振動峰,1 415.75 cm-1吸收峰是C—O對稱振動峰,1 051.20 cm-1及1 020.34 cm-1是C—O伸縮振動峰,644.22 cm-1掩蓋吸收峰是—OH搖擺振動峰,644.22 cm-1為—C≡CH鍵的彎曲振動峰的基頻峰,1 238.56 cm-1為其彎曲振動倍頻峰。表明CRP-2為多酮基不飽和多糖化合物。
從圖5c可以看出,3 446.79 cm-1為—OH鍵的強(qiáng)伸縮振動,3 288.63 cm-1為—NH2的以對稱伸縮振動峰,3 176.76 cm-1為—OH與—COOH的二聚體OH的伸縮振動,3 014.74 cm-1為芳環(huán)與不飽和碳的伸縮振動,2 360.87 cm-1為—CH彎曲振動,1 400~1 200 cm-1的吸收峰為C—H的變角振動吸收峰,其中,3 446.79 cm-1及2 360.87 cm-1為C—H變角振動峰是糖類化合物的特征峰。1 703.14 cm-1的吸收峰為酮基的C=O鍵的伸縮振動峰,1 687.71 cm-1的吸收峰為—CH2—CO—NH—等酰胺的C=O的伸縮振動峰,1 639.49 cm-1為順式或乙烯基的C=C的伸縮振動峰,1 413.38 cm-1吸收峰為—COOH的彎曲及伸縮振動峰,1 051.20 cm-1及1 020.34 cm-1為C—O伸縮振動峰,642.30 cm-1為—C≡CH鍵的彎曲振動峰的基頻峰。表明CRP-3為多酮基含羧基多不飽和多糖化合物。
近江牡蠣多糖CRP-1~3經(jīng)高碘酸氧化120 h后達(dá)到穩(wěn)定,吸光度分別為0.148、0.027、0.092,通過標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.053x-0.055 9(R2=0.991 8)計算,可知消耗高碘酸的量分別為0.19、0.08、0.14 mmol;用0.01 mol/L氫氧化鈉溶液滴定,得到甲酸生成量分別為0.041、0.037、0.043 mmol。近江牡蠣多糖CRP-1~3經(jīng)高碘酸氧化后生成甲酸,說明含有1→6位糖苷鍵或非還原末端(1→),高碘酸的消耗量大于甲酸生成量的2 倍,說明含有只消耗高碘酸而不產(chǎn)生甲酸的糖苷鍵,如1→2、1→4、1→2,4、1→4,6位糖苷鍵及不消耗高碘酸也不產(chǎn)生甲酸的1→3位糖苷鍵,根據(jù)甲酸消耗量推測CRP-1中1→6位或1→位連接的糖苷鍵為0.082 mol,以1→2位或1→4位鍵合的糖基為0.108 mol;CRP-2中1→6位或1→位連接的糖苷鍵為0.074 mol,以1→2位或1→4位鍵合的糖基為0.006 mol;CRP-3中1→6位或1→位連接的糖苷鍵為0.086 mol,以1→2位或1→4位鍵合的糖基為0.094 mol。
樣品經(jīng)過高碘酸氧化后,生成多糖醛,進(jìn)一步經(jīng)過Smith降解,多糖醛還原成醇類化合物,根據(jù)不同生成物質(zhì)判斷糖苷鍵連接方式,其中1→2位糖苷鍵還原,生成甘油;1→4位糖苷鍵還原,生成赤蘚醇和乙二醇;1→6位糖苷鍵還原,生成甘油和乙二醇;1→3位糖苷鍵不被氧化降解。將利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用對還原出的醇類化合物進(jìn)行定性,結(jié)果如圖6所示,得知CRP-1被還原出甘油、乙二醇及赤蘚醇,CRP-2被還原出甘油、赤蘚醇、乙二醇,CRP-3被還原出甘油及赤蘚醇,說明CRP-3中無1→4位及1→6位糖苷鍵。
圖6 醇類化合物標(biāo)準(zhǔn)品及近江牡蠣多糖Smith降解后的氣相色譜圖Fig. 6 Gas chromatograms of alcohol standards and Smith degradation products of CRP-1, 2 and 3
2.6.1 近江牡蠣多糖對細(xì)胞存活率的影響
為排除所用試樣對小鼠巨噬細(xì)胞有藥理毒害作用的因素,故以細(xì)胞存活率實驗檢驗其細(xì)胞毒性及給藥濃度。如圖7所示,各質(zhì)量濃度的近江牡蠣粗多糖及500 μg/mL的純化多糖與RAW264.7共同培養(yǎng)24 h,與對照組相比,細(xì)胞存活率無明顯差異,判斷近江牡蠣多糖不抑制巨噬細(xì)胞的正常生長作用(P>0.05),因此近江牡蠣多糖可用于后續(xù)的實驗研究。
圖7 不同質(zhì)量濃度近江牡蠣粗多糖CRRS-B和500 μg/mL CRP-1~3對RAW264.7細(xì)胞存活率的影響Fig. 7 Effects of different concentrations of CRRS-B and CRPs-1 through 3 at 500 μg/mL on survival rate of RAW264.7 cells
2.6.2 近江牡蠣多糖對小鼠巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響
圖8 不同質(zhì)量濃度近江牡蠣粗多糖CRRS-B和近江牡蠣純化多糖(500 μg/mL)CRP-1~3對RAW264.7吞噬中性紅的影響Fig. 8 Effects of different concentrations of CRRS-B and CRPs-1 through 3 (500 μg/mL) on neutral red phagocytosis of RAW264.7 cells
吞噬細(xì)胞的主要功能是吞噬病原體等異物[32],為了研究近江牡蠣多糖對巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響,檢測經(jīng)試樣培養(yǎng)的RAW264.7對中性紅試劑的吞噬功能。如圖8所示,與空白組相比,CRRS-B、CRP-1~3和LPS,均能使巨噬細(xì)胞的吞噬能力顯著增強(qiáng)(P<0.05),在同一質(zhì)量濃度下,近江牡蠣純化多糖對小鼠吞噬細(xì)胞中性紅吞噬能力的影響力排序為CRP-3>CRP-1>CRP-2。
2.6.3 近江牡蠣多糖對效應(yīng)因子和細(xì)胞因子分泌的影響2.6.3.1 近江牡蠣純化多糖對NO的影響
病原體、細(xì)胞碎片或外來異物刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生效應(yīng)因子,進(jìn)一步刺激其他免疫細(xì)胞的生成,以構(gòu)成機(jī)體免疫系統(tǒng),其中NO是巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的主要效應(yīng)分子和活性介質(zhì),激活淋巴球等其他免疫細(xì)胞而在非特異性免疫應(yīng)答中發(fā)揮主要細(xì)胞效應(yīng)[33-34]。如圖9所示,近江牡蠣多糖CRP-1、CRP-2及CRP-3能夠顯著增強(qiáng)小鼠巨噬細(xì)胞NO的生成能力(P<0.01),且CRP-3>CRP-1>CRP-2。
圖9 近江牡蠣純化多糖CRP-1~3(500 μg/mL)對RAW264.7 NO生成的影響Fig. 9 Effects of CRPs-1 through 3 (500 μg/mL) on NO production of RAW264.7 cells
2.6.3.2 近江牡蠣純化多糖對TNF-α、IL-6和IL-1β的影響
為了研究近江牡蠣多糖對小鼠巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的影響,采用酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒方法檢測細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的分泌。如圖10所示,與空白組相比,經(jīng)近江牡蠣多糖CRP-1、CRP-3和LPS處理組分泌的TNF-α、IL-6和IL-1β顯著提高(P<0.01),CRP-2能夠增強(qiáng)小鼠巨噬細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的分泌(P<0.05),且CRP-3>CRP-1>CRP-2,表明近江牡蠣多糖能夠顯著誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞生成TNF-α、IL-6和IL-1β,增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答能力。
2.6.4 近江牡蠣多糖對mRNA表達(dá)的影響
巨噬細(xì)胞分泌NO、TNF-α、IL-6和IL-1β等效應(yīng)因子和細(xì)胞因子,可有效激活其他免疫細(xì)胞,細(xì)胞因子的合成主要受相應(yīng)的一氧化氮合酶iNOS、TNF-α、IL-6和IL-1β等相關(guān)基因的調(diào)控,為了進(jìn)一步確認(rèn)近江牡蠣多糖對小鼠巨噬細(xì)胞NO生成和細(xì)胞因子分泌的影響,采用RT-PCR試劑盒法檢測近江牡蠣多糖對iNOS、TNF-α、IL-6和IL-1βmRNA相對表達(dá)的影響。
圖11 近江牡蠣純化多糖CRP-1~3(500 μg/mL)對RAW264.7 mRNA表達(dá)的影響Fig. 11 Effects of CRPs-1 through 3 (500 μg/mL) on mRNA expression levels of iNOS and cytokines in RAW264.7 cells
如圖11所示,經(jīng)CRP-1~3和LPS處理后,RAW264.7中iNOS、TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA表達(dá)均被顯著上調(diào)(P<0.01),CRP-3>CRP-1>CRP-2,證明近江牡蠣多糖能夠通過誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞上調(diào)相關(guān)基因的表達(dá),生成效應(yīng)因子NO和分泌細(xì)胞因子,從而激活免疫應(yīng)答。
CRP-1的總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(32.40±0.89)%,分子質(zhì)量為124.5 kDa,是組分均一的多糖,由甘露糖、核糖、氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、氨基半乳糖、半乳糖、阿拉伯糖組成,9 種單糖的物質(zhì)的量比為5.55∶0.32∶9.08∶0.47∶0.66∶48.13∶3.57∶8.53∶0.30。CRP-2的總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(78.50±1.90)%,分子質(zhì)量為67.0 kDa,是由甘露糖、核糖、氨基葡萄糖、葡萄糖、氨基半乳糖、半乳糖組成,6 種單糖的物質(zhì)的量比為7.79∶0.41∶12.69∶32.08∶4.98∶15.92。CRP-3的總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(73.46±2.19)%,分子質(zhì)量為8.3 kDa,是由氨基葡萄糖、半乳糖醛酸、葡萄糖組成,3 種單糖的物質(zhì)的量比為8.91∶5.71∶10.15。傅里葉變換紅外光譜分析結(jié)果顯示,CRP-1為多醛基吡喃環(huán)糖苷的多糖化合物;CRP-2為多酮基不飽和多糖化合物;CRP-3為多酮基含羧基多不飽和多糖化合物。
以小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7為模型,證明近江牡蠣多糖CRP-1~3能夠增強(qiáng)巨噬細(xì)胞中性紅的吞噬能力,具有免疫調(diào)節(jié)活性;且近江牡蠣純化多糖CRP-1~3能夠顯著增強(qiáng)小鼠巨噬細(xì)胞效應(yīng)因子NO和細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的分泌,上調(diào)mRNA表達(dá)iNOS、TNF-α、IL-6和IL-1β等細(xì)胞因子并誘導(dǎo)NO、TNF-α、IL-6、IL-1β等細(xì)胞因子的分泌,近江牡蠣純化多糖對小鼠巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)活性大小為CRP-3>CRP-1>CRP-2。
本實驗采用分級膜分離聯(lián)產(chǎn)制備近江牡蠣多糖及近江牡蠣多肽,并對近江牡蠣多糖進(jìn)行分子質(zhì)量測定、DEAE-52純化、單糖組成分析、傅里葉變換紅外光譜測定、糖苷鍵類型測定及免疫活性測定,結(jié)果表明聯(lián)產(chǎn)制備出的近江牡蠣多糖具有制備價值。
CRP-3的氨基葡萄糖和半乳糖醛酸的相對含量遠(yuǎn)高于CRP-1和CRP-2,其酸性糖含量和己糖醛酸含量較高,且其分子質(zhì)量最小,因而CRP-3的免疫調(diào)節(jié)能力最高,此結(jié)論進(jìn)一步驗證了胡雪瓊等[13]對近江牡蠣糖胺聚糖的研究;對于CRP-1及CRP-2而言,兩者的主要差別為CRP-2的氨基葡萄糖和氨基半乳糖遠(yuǎn)高于CRP-1,推斷吞噬能力大小為CRP-1>CRP-2,由不同單糖組成差異導(dǎo)致,具體影響機(jī)制有待進(jìn)一步研究。