吳杰儒
(江西省婦幼保健院檢驗(yàn)科,南昌 330006)
復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(RSA)是指存在≥3次持續(xù)性自然流產(chǎn)現(xiàn)象,其病因與胚胎染色體異常、生殖道解剖異常、內(nèi)分泌異常等因素有關(guān),但有40%~50%的患者流產(chǎn)原因不明確,稱(chēng)為不明原因反復(fù)流產(chǎn)(URSA)[1]。有研究[2]發(fā)現(xiàn),母體的妊娠免疫耐受失衡與URSA發(fā)生有關(guān),而妊娠免疫耐受失衡常伴隨著T細(xì)胞的異常增殖活化和細(xì)胞因子的異常分泌。程序性細(xì)胞死亡分子-1(PD-1)作為重要的抑制性共刺激分子,通過(guò)抑制T細(xì)胞的活化和增殖負(fù)性調(diào)控免疫應(yīng)答。鑒于此,本研究探討URSA患者T細(xì)胞中PD-1的表達(dá)及其臨床意義,現(xiàn)報(bào)告如下。
選擇2018年5月至2019年5月江西省婦幼保健院收治的URSA患者20例(URSA組),選擇同期行人工流產(chǎn)的正常健康早孕婦女20例作為對(duì)照組。URSA組,年齡22~35歲,平均(28.67±3.16)歲;孕周5~12周,平均(8.75±2.13)周。對(duì)照組,年齡21~35歲,平均(28.39±3.02)歲;孕周4~12周,平均(8.28±2.35)周。2組一般資料比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可對(duì)比性。知情同意書(shū)均由患者及其家屬簽署,且經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。
URSA患者既往無(wú)活產(chǎn)史,自身抗體陰性;對(duì)照組有活產(chǎn)史,無(wú)自然流產(chǎn)、死胎或死產(chǎn)史,孕期無(wú)腹痛及陰道出血,B超提示胚胎發(fā)育正常。排除標(biāo)準(zhǔn):精神障礙者;嚴(yán)重器官功能異常者;有染色體異常、生殖道解剖異常、內(nèi)分泌異常等。
經(jīng)患者知情同意后,采集研究對(duì)象的部分蛻膜組織和外周血,以磷酸鹽緩沖液(PBS)浸泡漂洗蛻膜,2 h內(nèi)分離單個(gè)核細(xì)胞,重懸后備用。分離外周血和蛻膜組織中單個(gè)核細(xì)胞。單個(gè)核細(xì)胞中CD3+PD-1+T細(xì)胞的表達(dá)檢測(cè):取5 μL的CD3-FITC及PD-1-PE加入100 μL PBMCs懸液,設(shè)立同型對(duì)照,室溫15 min避光孵育;加2 mL Buffer洗滌,10 min、300×g離心,棄上清液;加Buffer重懸細(xì)胞500 μL,流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman Coulter公司,型號(hào):CyAN-ADP)檢測(cè)CD3+PD-1+T細(xì)胞的表達(dá)情況,結(jié)果用百分比(%)表示。血漿中細(xì)胞因子含量檢測(cè):依據(jù)試劑盒操作步驟流程,用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)外周血白細(xì)胞介素4(IL-4)、白細(xì)胞介素10(IL-10)、干擾素-γ(IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的水平。
記錄外周血及脫膜組織CD3+PD-1+T細(xì)胞的表達(dá);比較外周血IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-α的水平。
數(shù)據(jù)由SPSS18.0軟件處理,計(jì)量資料采用t檢驗(yàn),相關(guān)性采用一般線(xiàn)性雙變量Pearson相關(guān)性檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
與對(duì)照組相比,URSA組外周血及蛻膜組織CD3+PD-1+T細(xì)胞的表達(dá)更低(P<0.05),見(jiàn)表1。
組別n外周血CD3+PD-1+T脫膜組織CD3+PD-1+T對(duì)照組2019.98±2.3731.09±4.05URSA組2014.27±1.3820.15±3.13t9.3119.558P<0.001<0.001
與對(duì)照組相比,URSA組IL-4、IL-10水平更低,IFN-γ、TNF-α水平更高(P<0.05),見(jiàn)表2。
組別nIL-4ρ/(ng·L-1)IL-10ρ/(ng·L-1)IFN-γρ/(pg/mL)TNF-αρ/(ng·L-1)對(duì)照組2047.44±8.9216.65±5.0972.87±19.1322.61±9.06URSA組2024.65±9.087.38±2.11188.85±77.5945.52±15.69t8.0077.5246.4915.655P<0.001<0.001<0.001<0.001
經(jīng)Pearson相關(guān)性檢驗(yàn),URSA與外周血PD-1、蛻膜PD-1、IL-4、IL-10呈負(fù)相關(guān)(r<0,P<0.05);URSA與IFN-γ、TNF-α呈正相關(guān)(r>0,P<0.05)。見(jiàn)表3。
表3 URSA與PD-1和IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-α水平的相關(guān)性
在正常妊娠過(guò)程中,胚胎作為一種特殊的同種異體移植物,其在母體內(nèi)存活并正常發(fā)育,母體的免疫系統(tǒng)需對(duì)胚胎產(chǎn)生免疫耐受,而特異性免疫抑制物及非特異性因子,可共同維持母體免疫系統(tǒng)對(duì)胚胎的免疫耐受,同時(shí)機(jī)體的多種免疫學(xué)因素通過(guò)有機(jī)協(xié)調(diào)參與妊娠免疫平衡,若胚胎免疫耐受降低,則可能導(dǎo)致流產(chǎn)[3-4]。
目前,URSA的免疫因素研究主要包含經(jīng)典B7途徑的CD28、CTLA-4等,和Treg細(xì)胞及其相關(guān)的Th細(xì)胞因子。PD-1屬于細(xì)胞負(fù)性調(diào)節(jié)分子,可抑制T細(xì)胞活化,增殖負(fù)性調(diào)控免疫應(yīng)答,并在調(diào)節(jié)免疫耐受、微生物感染及腫瘤免疫逃逸中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,URSA組外周血及蛻膜組織CD3+PD-1+T細(xì)胞的表達(dá)更低,IL-4、IL-10水平更低,IFN-γ、TNF-α水平更高;經(jīng)Pearson相關(guān)性檢驗(yàn),URSA與外周血PD-1、蛻膜PD-1、IL-4、IL-1呈負(fù)相關(guān)(r<0,P<0.05),與IFN-γ、TNF-α呈正相關(guān)(r>0,P<0.05),提示URSA患者外周血和蛻膜組織中CD3+PD-1+T細(xì)胞的表達(dá)降低,通過(guò)調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子,參與URSA發(fā)生。PD-1對(duì)維持免疫耐受及母胎免疫平衡,抑制免疫排斥具有重要意義,在正常妊娠中,PD-1可結(jié)合其配體PD-L1,負(fù)性調(diào)節(jié)T細(xì)胞受體信號(hào),降低Th1細(xì)胞的增殖,阻礙IFN-γ、TNF-α等促炎因子的產(chǎn)生,同時(shí)激活Th2細(xì)胞,使IL-4、IL-10等抑炎因子處于高表達(dá),進(jìn)而維持免疫耐受[5]。IFN-γ對(duì)胚胎具有毒性作用,會(huì)抑制胚胎正常發(fā)育,導(dǎo)致流產(chǎn)現(xiàn)象[6]。但在胚胎正常發(fā)育過(guò)程中,TNF-α?xí)cTNF受體大量結(jié)合,進(jìn)而阻礙滋養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)、繁殖,干擾胚胎發(fā)育的營(yíng)養(yǎng)供給,使胚胎著床難度增加[7]。IL-4、IL-10可維持正常妊娠,減少流產(chǎn)現(xiàn)象。因PD-1對(duì)單核細(xì)胞的抑制作用減弱,使URSA患者體內(nèi)處于高水平的炎癥狀態(tài),抑炎性細(xì)胞因子減少,促炎因子增多,從而參與URSA發(fā)病[8]。造成URSA的主要原因是由于免疫耐受遭到破壞,但其具體機(jī)制需進(jìn)一步研究和探討[9]。
總之,PD-1通過(guò)調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子而影響免疫平衡,參與URSA發(fā)病,可為治療URSA潛在靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。