林娜陸壯念楊麗娟張棟張淑華

(1.右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院兒科，廣西 百色 533000；2.右江民族醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，廣西 百色 533000)

哮喘是兒童時期最常見的氣道變應(yīng)性疾病，以嗜酸性炎癥、黏液分泌增多、氣道高反應(yīng)性為特征，主要由輔助性T細(xì)胞2(Th2)及其細(xì)胞因子IL-4、IL-5、IL-13介導(dǎo)，Th1/Th2失衡是哮喘發(fā)生的關(guān)鍵因素，IgE在哮喘發(fā)生發(fā)展中也發(fā)揮重要作用。但近期研究發(fā)現(xiàn)[1]包括輔助性T細(xì)胞17(Th17)、固有淋巴細(xì)胞(ILCs)在內(nèi)的其他炎性細(xì)胞在哮喘的發(fā)病過程中也發(fā)揮重要作用。IL-17主要由Th17細(xì)胞產(chǎn)生，是一種重要的促炎因子，可以促進(jìn)其他細(xì)胞因子如：IL-1β、IL-8、IL-6等炎癥因子釋放，進(jìn)而使炎癥反應(yīng)放大，同時也可以刺激機體固有免疫細(xì)胞及調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞表達(dá)從而發(fā)揮促炎作用。在支氣管哮喘中，IL-17通過調(diào)節(jié)固有免疫及招募中性粒細(xì)胞至氣道上皮細(xì)胞，從而促進(jìn)哮喘發(fā)生發(fā)展。IL-17A是IL-17家族中最主要的成員，Hasegawa等[2]研究發(fā)現(xiàn)在難治性哮喘患者血清中IL-17A表達(dá)水平明顯升高，說明IL-17A可能參與支氣管哮喘的發(fā)病發(fā)展過程。IL-17A基因rs2275913位點多態(tài)性與支氣管哮喘的關(guān)系也有報道[3]，但結(jié)果仍存在爭議，本文探討IL-17A基因rs2275913位點多態(tài)性及血清IL-17A、IgE表達(dá)水平與廣西黑衣壯哮喘兒童關(guān)系，報道如下。

1 對象和方法

1.1 研究對象 選擇2018年5月—2019年5月在右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院就診的廣西黑衣壯哮喘患兒121例，其中男58例，女63例，哮喘診斷符合2016年兒童支氣管哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]，患兒1個月內(nèi)未使用糖皮質(zhì)激素。選擇同期在右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院兒童保健科體檢115例血生化指標(biāo)及運動發(fā)育均正常的廣西黑衣壯健康兒童作為對照組，其中男67例，女48例，無過敏史，家族中無哮喘及其他免疫性疾病患者。兩組受試者祖輩三代以上均為廣西黑衣壯，相互之間無血緣關(guān)系。兩組間年齡、性別比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05) 。本研究已獲得我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，研究對象和/或監(jiān)護(hù)人已知情并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本的采集 采集研究對象空腹外周靜脈血4 ml，2 ml放于EDTA抗凝管中，用于提取DNA；2 ml存放于生化采血管，室溫靜置1 h后離心10 min(條件：3000 r/min)，將上清液轉(zhuǎn)移至2個EP管中，分別用于血清IL-17A及IgE水平測定。所有標(biāo)本放置-80℃冰箱保存待檢。

1.2.2 IL-17A血清水平測定 采用雙抗體夾心ELISA法檢測，嚴(yán)格按照人IL-17A ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.3 血清IgE水平測定 采用全自動生化分析儀測定標(biāo)本血清IgE水平，由我院檢驗科協(xié)助完成。

1.2.4 DNA提取 嚴(yán)格按照離心柱型血液基因組DNA提取試劑盒里描述的步驟提取DNA。

1.2.5 引物的合成 通過primer3在線軟件(http://primer3.ut.ee/)設(shè)計引物，由捷瑞生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行合成，擴增rs2275913位點的引物(見表1)。

表1 rs2275913位點的引物序列

1.2.6 PCR反應(yīng)和基因測序 ①PCR擴增：采用15 μl反應(yīng)體系，其中包括2.0 μl模板DNA，10×Buffer 1.5 μl 、Mg2+1.5 μl、1 U Taq酶、0.3 μl dNTP、1 μl多重PCR引物，剩余的體積用雙蒸水補足至15 μl，充分混勻，離心，上PCR儀(東勝龍黑金剛EDC-810 PCR儀)。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性 2 min；擴增階段: 95℃× 3 min，94 ℃× 15 s，55℃ ×15 s，72℃ 30 s( 35 cycles)；最后72℃ 延伸3 min。②PCR產(chǎn)物純化：PCR擴增后取3 μl產(chǎn)物用0.2 μl ExoI(Fermentas公司)和0.8 μl FastAP(Fermentas公司)純化。③延伸反應(yīng)體系：PCR產(chǎn)物2 μl；Snapshot Multiplex kit 1 μl；延伸引物1 μl；雙蒸水補至6 μl。延伸反應(yīng)程序：96℃×1 min；96℃×10 s，52℃×5 s(30 cycles)；60℃×30 s。④測序：延伸產(chǎn)物取1 μl加入10 μlbuffer，95℃變性3 min，立即冰水浴，上測序儀(ABI3730xl)。

1.2.7 基因分型 單核苷酸多態(tài)性( single nuleotide polymorphism，SNP) 分型采用GeneMapper 4.1軟件進(jìn)行分析(上海捷瑞生物工程有限公司協(xié)助完成)。

2 結(jié)果

2.1 IL-17A基因rs2275913位點基因分型 經(jīng)Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗分析，P>0.05，表明所選的樣本符合Hardy-Weinberg遺傳平衡，具有群體代表性。rs2275913位點存在AA、AG、GG三種基因型，基因型峰型見圖1。

注：A為AA基因型峰型；B為AG基因型峰型；C為GG基因型峰型

2.2 IL-17A基因rs2275913位點多態(tài)性與哮喘易感性關(guān)聯(lián)分析 采用Logistic回歸分析比較IL-17A基因rs2275913位點多態(tài)性在對照組和哮喘組間差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IL-17A基因rs2275913位點基因型和等位基因在哮喘組和健康組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；納入年齡和性別調(diào)整后差異仍具有統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。

表2 rs2275913基因型及等位基因頻率在哮喘組和健康組間比較

注：①*為納入年齡和性別為調(diào)整因素；②表內(nèi)計數(shù)資料數(shù)據(jù)用[n(%)]表示

2.3 兩組間血清IL-17A、IgE水平比較 哮喘組血清IL-17A、IgE表達(dá)水平均明顯高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，見表3。

表3 血清IL-17A、IgE水平在哮喘組和健康組組間比較

2.4 血清IL-17A、IgE水平與廣西黑衣壯哮喘兒童的相關(guān)性分析 經(jīng)Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示IL-17A、IgE與廣西黑衣壯兒童哮喘呈正相關(guān)，r值與P分別為：r=0.496，P<0.001；r=0.866，P<0.001。

3 討論

支氣管哮喘是一種慢性異質(zhì)性疾病，各年齡階段均可發(fā)病，患病率呈逐年增長趨勢[5]，據(jù)統(tǒng)計全球有3億多哮喘患者[6]。哮喘受環(huán)境、遺傳等多方面影響，發(fā)病機制復(fù)雜，至今尚不完全清楚。人類基因組掃描發(fā)現(xiàn)染色體6P基因組區(qū)域與哮喘密切相關(guān)，IL-17A基因位于6p12.1上，該染色體區(qū)域也曾多次報道與哮喘相關(guān)[3，7]，因此IL-17A也被認(rèn)為是哮喘遺傳易感性候選基因之一。本研究發(fā)現(xiàn)IL-17A基因rs2275913位點與廣西黑衣壯兒童哮喘密切相關(guān)，AG基因型和G等位基因可能具有降低哮喘發(fā)病的風(fēng)險；血清IL-17A、IgE表達(dá)水平在哮喘組和對照組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，且血清IL-17A、IgE表達(dá)水平與哮喘呈正相關(guān)。

rs2275913位點位于IL-17A基因啟動子位置，堿基的改變可以影響正常的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程，可能使體內(nèi)IL-17A表達(dá)水平發(fā)生變化，進(jìn)而引起個體對疾病的易感性差異。研究發(fā)現(xiàn)IL-17A基因rs2275913多態(tài)性可能與強直性脊柱炎[8]、系統(tǒng)性紅斑狼瘡[9]、胃癌[10]等相關(guān)。郭建等[10]通過Meta分析發(fā)現(xiàn)rs2275913位點多態(tài)性與胃癌發(fā)生相關(guān)，且攜帶A等位基因者患胃癌的風(fēng)險更高，與殷珍珍等[7]人的研究結(jié)果一致。與此同時，IL-17A基因rs2275913位點多態(tài)性與支氣管哮喘的關(guān)系也有報道，但結(jié)果并不全相同，如：孫先琳等[11]研究發(fā)現(xiàn)rs2275913位點多態(tài)性與兒童支氣管哮喘發(fā)病密切相關(guān)，攜帶AA基因型者發(fā)生哮喘的風(fēng)險明顯高于攜帶GG基因型者，且AA基因型可能與哮喘的嚴(yán)重程度及肺功能異常相關(guān)。此外，李欣艷等[3]研究也發(fā)現(xiàn)IL-17A-152G/A(rs2275913)多態(tài)性可能與貴州地區(qū)兒童哮喘發(fā)病相關(guān)且AA基因型可能增加哮喘發(fā)病風(fēng)險。然而，Wang等[12]研究發(fā)現(xiàn)IL-17A基因rs2275913位點多態(tài)性可能與臺灣地區(qū)漢族兒童哮喘發(fā)病無關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)IL-17A基因rs2275913位點檢測出AA、AG、GG三種基因型，兩組間基因型和等位基因分布比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義，logistic回歸分析納入年齡和性別調(diào)整后，差異仍具有統(tǒng)計學(xué)意義，表明IL-17A基因rs2275913位點多態(tài)性可能與廣西黑衣壯兒童哮喘的遺傳易感性相關(guān)，G等位基因可能是廣西黑衣壯兒童哮喘發(fā)生的保護(hù)因素，與李欣艷等[3]、孫先琳等[11]研究結(jié)果一致。但本次研究樣本量較小，可以擴大樣本量進(jìn)一步研究，并在不同民族及人種間比較，尋找哮喘相關(guān)特異性基因，為哮喘的基因治療奠定基礎(chǔ)。

IL-17A是IL-17家族中最早發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子，研究也較多，Honda等[13]表明IL-17A能刺激腫瘤壞死因子β(TNF-β)誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞生成IL-8，中性粒細(xì)胞產(chǎn)生趨化和活化，從而促進(jìn)氣道炎癥反應(yīng)。魏秀娟等[1]發(fā)現(xiàn)支氣管哮喘急性發(fā)作期患兒外周血Th17細(xì)胞百分比、IL-17表達(dá)水平明顯高于緩解期患兒。Hasegawa等[2]研究發(fā)現(xiàn)哮喘患者血液中IL-17A表達(dá)水平較對照組明顯升高，且在難治性哮喘患者血液中IL-17A表達(dá)水平則更高，與Dimitrova等[14]研究的結(jié)果一致。本研究發(fā)現(xiàn)，在廣西黑衣壯哮喘兒童中，血清IL-17A表達(dá)水平較健康對照組明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，進(jìn)一步采用Spearman相關(guān)性分析血清IL-17A水平與廣西黑衣壯哮喘兒童關(guān)系性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IL-17A血清表達(dá)水平與哮喘呈正相關(guān)，說明血清中高水平的IL-17A可能是廣西黑衣壯兒童發(fā)生哮喘的危險因素。

IgE高表達(dá)是哮喘的特征之一，其介導(dǎo)Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)，當(dāng)機體再次接觸過敏原時，IgE效應(yīng)細(xì)胞發(fā)生脫顆粒，釋放多種炎癥介質(zhì)，導(dǎo)致哮喘的氣道高反應(yīng)、氣道重塑等發(fā)生。徐影等[15]研究發(fā)現(xiàn)外周血IgE水平可能是評估兒童哮喘病情嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)。Rath等[16]研究也發(fā)現(xiàn)與IgE正?；蚪档偷南M比較，高IgE哮喘組急性發(fā)作及使用糖皮質(zhì)激素次數(shù)更多，檢測肺功能FEV1%數(shù)值、哮喘控制實驗評分更低。本研究發(fā)現(xiàn)，黑衣壯哮喘兒童外周血IgE水平明顯高于健康對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，采用Spearman相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)血清IgE水平與廣西黑衣壯兒童哮喘密切相關(guān)。

綜上所述，IL-17A基因rs2275913位點多態(tài)性及血清IL-17A、IgE表達(dá)水平可能與廣西黑衣壯兒童哮喘發(fā)病存在相關(guān)性。