于沛，王修俊*，商景天，馮廷萃

(1.貴州大學(xué)發(fā)酵工程與生物制藥省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽 550025；2.貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院， 貴陽 550025；3鎮(zhèn)遠(yuǎn)縣名城食品廠，貴州 鎮(zhèn)遠(yuǎn) 557700)

泡菜是將新鮮蔬菜利用中低濃度食鹽水進(jìn)行泡漬腌制，通過前期微生物(乳酸菌為主)發(fā)酵、后期調(diào)味加工制成的產(chǎn)品[1]。乳酸菌是一類能夠發(fā)酵碳水化合物且產(chǎn)乳酸的革蘭氏陽性細(xì)菌的統(tǒng)稱[2]。

亞硝酸鹽(nitrite，NIT)的安全控制一直是泡菜發(fā)酵過程中的關(guān)鍵問題之一，亞硝酸鹽能使血紅蛋白氧化為高鐵血紅蛋白，導(dǎo)致低氧血癥[3]；亞硝酸鹽在人體內(nèi)會(huì)積累轉(zhuǎn)變?yōu)閬喯醢?，可?dǎo)致胃癌、甲狀腺癌等[4,5]。自然發(fā)酵的泡菜存在著發(fā)酵周期長、亞硝酸鹽含量不可控等問題[6]。許多研究表明乳酸菌在泡菜發(fā)酵過程中有降解亞硝酸鹽的作用[7,8]，降解機(jī)理為乳酸菌可產(chǎn)酸和產(chǎn)亞硝酸鹽還原酶[9]。故生產(chǎn)上常采用直投式乳酸菌發(fā)酵，使亞硝酸鹽含量可控，繼而有許多具有優(yōu)良性能的乳酸菌菌株被篩選鑒定[10]。本實(shí)驗(yàn)室前期就從自然發(fā)酵泡菜中篩選出一株有高效降解亞硝酸鹽功能的優(yōu)勢菌株LP-7501S，現(xiàn)以蘿卜作為原料，利用LP-7501S進(jìn)行強(qiáng)化發(fā)酵，以蔗糖添加量、食鹽添加量、氮源添加量、發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度進(jìn)行單因素試驗(yàn)與正交試驗(yàn)，研究LP-7501S降解亞硝酸鹽的最佳發(fā)酵工藝，為泡菜發(fā)酵過程中亞硝酸鹽降解及控制提供更有效的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

試驗(yàn)原料：蘿卜，貴陽市花溪區(qū)吉林村農(nóng)貿(mào)市場。

試驗(yàn)試劑：食用鹽，四川省南充順城鹽化有限責(zé)任公司；蔗糖，太古糖業(yè)(中國)有限公司；酵母抽提物(生化試劑)；亞鐵氰化鉀；乙酸鋅；冰乙酸；硼酸鈉；鹽酸；對(duì)氨基苯磺酸；鹽酸萘乙二胺。

1.1.2 試驗(yàn)儀器

電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱 上海賀德試驗(yàn)設(shè)備有限公司；恒溫恒濕培養(yǎng)箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；722型分光光度計(jì) 上海佑科儀表儀器有限公司；酸度計(jì) 上海理達(dá)儀器廠。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程

1.2.2 發(fā)酵蘿卜中NIT降解工藝的單因素試驗(yàn)

1.2.2.1 自然發(fā)酵蘿卜中總酸和NIT含量變化測定

選取外觀飽滿、無破損的新鮮蘿卜，洗凈、瀝干后切成1.5 cm3大小的正方體，裝壇，加入含4%食鹽和0.7%蔗糖的發(fā)酵液(發(fā)酵液∶蘿卜為1.5∶1)，用10%鹽水水封后于30 ℃下發(fā)酵9 d，每隔1 d取樣，根據(jù)GB/T 12456-2008中pH電位法和GB 5009.33-2016中鹽酸萘乙二胺分光光度計(jì)比色法測定樣品中總酸與NIT含量[11，12]。

1.2.2.2 糖類添加量對(duì)總酸和NIT的影響

選用0.4%、0.7%、1.0%、1.3%、1.6% 5個(gè)濃度梯度來進(jìn)行研究，試驗(yàn)其余條件一致：4%食鹽，0.7%氮源，發(fā)酵液中LP-7501S接種量106CFU/mL，30 ℃發(fā)酵6 d，每隔1 d取樣測定總酸與NIT含量。

1.2.2.3 食鹽添加量對(duì)總酸和NIT的影響

以傳統(tǒng)自然發(fā)酵蘿卜中的食鹽添加量為參考指標(biāo)，對(duì)3%、4%、5%、6%、7% 5個(gè)食鹽濃度梯度進(jìn)行研究，試驗(yàn)其余條件一致：0.7%糖，0.7%氮源，發(fā)酵液中LP-7501S接種量106CFU/mL，30 ℃發(fā)酵6 d，每隔1 d取樣測定總酸與NIT含量。

1.2.2.4 氮源添加量對(duì)總酸和NIT的影響

因蘿卜的組成成分中蛋白質(zhì)的含量僅為1.2 mg/g左右[13]，所以氮源的添加量直接影響LP-7501S的生長繁殖，從而影響泡菜中的總酸和NIT含量。以蘿卜中蛋白質(zhì)的含量為參考依據(jù)，試驗(yàn)分別對(duì)0.4%、0.7%、1.0%、1.3%、1.6% 5個(gè)氮源添加量進(jìn)行研究，其余發(fā)酵條件為：4%食鹽，0.7%糖，發(fā)酵液中LP-7501S接種量106CFU/mL，30 ℃發(fā)酵6 d，每隔1 d取樣測定總酸與NIT含量。

1.2.2.5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)總酸和NIT的影響

腌制天數(shù)的長短對(duì)泡菜的軟脆度及風(fēng)味變化有所影響，腌制過久，口感會(huì)稍差或變得不佳[14]。以食鹽添加量為4%，糖類添加量為0.7%，氮源添加量為0.7%，發(fā)酵液中LP-7501S接種量為106CFU/mL，于30 ℃下對(duì)蘿卜發(fā)酵6 d，每隔1 d取樣測定總酸與NIT含量。

1.2.2.6 發(fā)酵溫度對(duì)總酸和NIT的影響

試驗(yàn)分別以20，26，30，33，37，40 ℃ 6個(gè)溫度梯度進(jìn)行研究，其余發(fā)酵條件一致：4%食鹽，0.7%糖，0.7%氮源，發(fā)酵液中LP-7501S接種量106CFU/mL，發(fā)酵6 d，每隔1 d取樣測定總酸與NIT含量。

1.2.3 發(fā)酵蘿卜中NIT降解工藝的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)[15]

以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，選取蔗糖濃度(A)、食鹽濃度(B)、氮源添加量(C)、發(fā)酵時(shí)間(D)、發(fā)酵溫度(E)5個(gè)因素按L16(45)正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)，以NIT含量和總酸為指標(biāo)研究LP-7501S發(fā)酵蘿卜的最佳因素，研究不同因素對(duì)發(fā)酵蘿卜中NIT和總酸含量的影響，試驗(yàn)因素水平表見表1。使用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析確定NIT降解的最佳發(fā)酵工藝。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 自然發(fā)酵蘿卜中總酸和NIT含量變化

圖1 自然發(fā)酵過程中總酸含量變化Fig.1 The change of total acid content in natural fermentation process

由圖1可知，9 d內(nèi)發(fā)酵蘿卜中總酸含量隨發(fā)酵時(shí)間先上升而后趨于穩(wěn)定的趨勢，原因可能是乳酸菌等在發(fā)酵初期生長代謝產(chǎn)較多酸導(dǎo)致總酸含量上升，而5 d之后發(fā)酵體系中總酸含量偏高，使乳酸菌生長代謝產(chǎn)酸受到抑制，總酸含量趨于穩(wěn)定。

圖2 自然發(fā)酵蘿卜NIT含量變化Fig.2 The change of nitrite content in naturally fermented radish

由圖2可知，在3 d內(nèi)樣品中NIT含量隨發(fā)酵時(shí)間的延長而逐漸增大，NIT含量于3 d時(shí)達(dá)到最高值14.20 mg/kg；3 d后因泡菜中乳酸菌群的生長繁殖、代謝產(chǎn)酸和產(chǎn)酶，導(dǎo)致NIT被降解，結(jié)合圖1可知，6 d后因樣品中的總酸含量趨于穩(wěn)定，NIT的酸降解途徑受到抑制，同時(shí)總酸含量偏高抑制了亞硝酸鹽還原酶的酶活性，使NIT含量趨于穩(wěn)定。

2.2 糖添加量對(duì)總酸和NIT含量的影響

糖添加量對(duì)發(fā)酵蘿卜總酸和NIT含量的影響結(jié)果見圖3和圖4。

由圖3可知，各組在發(fā)酵3 d內(nèi)因LP-7501S的生長代謝產(chǎn)酸，故總酸含量呈上升趨勢；3 d時(shí)，總酸含量升高使LP-7501S生長代謝受到抑制，所以總酸含量趨于穩(wěn)定。根據(jù)糖添加量的不同，在1 d內(nèi)各組產(chǎn)酸差別較大，而到2 d后產(chǎn)酸差別較小。原因可能為LP-7501S在有較多糖的條件下能迅速代謝產(chǎn)生較多的有機(jī)酸。

圖3 糖添加量對(duì)總酸含量的影響Fig.3 The effect of sucrose additive amount on total acid content

圖4 糖添加量對(duì)NIT含量的影響Fig.4 The effect of sucrose additive amount on nitrite content

由圖4可知，在1 d內(nèi)各組泡菜中NIT含量均迅速增加，結(jié)合總酸產(chǎn)量可得出在發(fā)酵初期，LP-7501S產(chǎn)酸總量相對(duì)較少，泡菜中的總酸含量低，不能抑制部分雜菌的生長代謝，導(dǎo)致蘿卜中硝酸鹽被還原，引起NIT含量升高，之后LP-7501S大量生長成為優(yōu)勢菌株，產(chǎn)生大量有機(jī)酸和亞硝酸鹽還原酶，使大量NIT被降解。之后因?yàn)榭偹岷枯^高，導(dǎo)致泡蘿卜中的其他雜菌生長和酶活同時(shí)受到抑制，最終使NIT含量趨于穩(wěn)定。

結(jié)合圖3和圖4可知，糖添加量對(duì)LP-7501S代謝產(chǎn)酸和降解NIT影響較小，但是糖類的添加會(huì)影響泡菜發(fā)酵口感和風(fēng)味。因此，結(jié)合表2中感官評(píng)價(jià)，從NIT、總酸、感官和經(jīng)濟(jì)效益角度考慮，選用蔗糖作為實(shí)際發(fā)酵的添加糖類，最佳添加量為0.7%左右。

表2 不同糖添加量發(fā)酵蘿卜感官評(píng)價(jià)Table 2 The sensory evaluation criteria of fermented radish with different sugar additive amount

2.3 食鹽添加量對(duì)總酸和NIT含量的影響

食鹽濃度對(duì)發(fā)酵蘿卜總酸和NIT含量的影響結(jié)果見圖5和圖6。

圖5 食鹽添加量對(duì)總酸含量的影響Fig.5 The effect of salt additive amount on total acid content

圖6 食鹽添加量對(duì)NIT含量的影響Fig.6 The effect of salt additive amount on nitrite content

由圖5可知，在泡菜發(fā)酵過程中，發(fā)酵體系內(nèi)食鹽含量越高，總酸產(chǎn)量越低。由圖6可知，發(fā)酵體系內(nèi)食鹽含量越高，對(duì)LP-7501S降解NIT能力的抑制作用越強(qiáng)，原因?yàn)楦啕}濃度會(huì)抑制LP-7501S產(chǎn)酸和亞硝酸鹽還原酶的酶活性，導(dǎo)致NIT降解緩慢，同時(shí)有一些耐鹽雜菌會(huì)大量繁殖，可能會(huì)使NIT產(chǎn)生量增多。發(fā)酵2 d后，食鹽添加量為3%、4%和5%的泡菜中的NIT含量都在1.0 mg/kg以下，結(jié)合表3中感官評(píng)價(jià)，選擇食鹽添加量為4%左右。

表3 不同食鹽添加量發(fā)酵蘿卜感官評(píng)價(jià)Table 3 The sensory evaluation criteria of fermented radish with different salt additive amount

2.4 氮源添加量對(duì)總酸和NIT含量的影響

氮源對(duì)發(fā)酵蘿卜總酸和NIT含量的影響結(jié)果見圖7和圖8。

圖7 氮源添加量對(duì)總酸含量的影響Fig.7 The effect of nitrogen source additive amount on total acid content

由圖7可知，在3 d內(nèi)，氮源添加量越大，產(chǎn)酸速度越快，總酸含量增加越迅速。

圖8 氮源添加量對(duì)NIT含量的影響Fig.8 The effect of nitrogen source additive amount on nitrite content

由圖8可知，氮源添加量越多，NIT降解速度越快，原因可能是大量的氮源能使LP-7501S在短時(shí)間內(nèi)迅速生長繁殖，成為優(yōu)勢菌株，產(chǎn)生大量有機(jī)酸。但氮源過多會(huì)導(dǎo)致兩大不利因素：一是發(fā)酵速度過快，產(chǎn)酸過多導(dǎo)致泡蘿卜酸味重，影響蘿卜結(jié)構(gòu)，同時(shí)氮源本身會(huì)影響泡蘿卜風(fēng)味；二是氮源添加量過多會(huì)在發(fā)酵后期LP-7501S生長受抑制時(shí)導(dǎo)致某些雜菌大量生長，結(jié)合表4的感官評(píng)價(jià)，綜合考慮，選擇碳源的添加量為0.7%左右。

表4 不同氮源添加量發(fā)酵蘿卜感官評(píng)價(jià)Table 4 The sensory evaluation criteria of fermented radish with different nitrogen source additive amount

2.5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)總酸和NIT含量的影響

發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵蘿卜總酸和NIT含量的影響結(jié)果見圖9。

圖9 發(fā)酵時(shí)間對(duì)總酸和亞硝酸鹽含量的影響Fig.9 The effect of fermentation time on total acid and nitrite content

由圖9可知，1～3 d內(nèi)，樣品內(nèi)總酸含量上升較快，NIT降解迅速，說明LP-7501S在此階段生長繁殖迅速，代謝產(chǎn)酸、產(chǎn)酶量較高；3 d以后，總酸含量趨于穩(wěn)定，NIT含量也基本趨于穩(wěn)定，說明LP-7501S的生長受到酸度的抑制作用。因此，綜合考慮，選擇發(fā)酵時(shí)間為3～4 d。

2.6 發(fā)酵溫度對(duì)總酸和NIT含量的影響

發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵蘿卜總酸和NIT含量的影響結(jié)果見圖10和圖11。

圖10 發(fā)酵溫度對(duì)總酸含量的影響Fig.10 The effect of fermentation temperature on total acid content

圖11 發(fā)酵溫度對(duì)NIT含量的影響Fig.11 The effect of fermentation temperature on nitrite content

由圖10可知，在30 ℃和33 ℃的發(fā)酵體系中總酸含量增加較快，故LP-7501S在泡菜中的適宜代謝產(chǎn)酸溫度應(yīng)該為30～33 ℃，而由圖11可知，NIT的峰值和終值均在30～33 ℃條件下較低，分析原因可能是LP-7501S在30～33 ℃時(shí)生長繁殖迅速，在發(fā)酵體系中能迅速成為優(yōu)勢菌群，同時(shí)結(jié)合圖10可知，LP-7501S在30～33 ℃條件下產(chǎn)酸速率最快，使生成的NIT迅速降解，同時(shí)較高的酸度抑制部分能產(chǎn)生NIT的雜菌生長代謝，阻斷了NIT生成。但泡菜發(fā)酵過程中，過高的溫度可能會(huì)引起一些丁酸細(xì)菌大量繁殖，產(chǎn)生氨等一些不良的風(fēng)味物質(zhì)，使泡菜成品的品質(zhì)下降，故綜合考慮，以30 ℃作為LP-7501S接種發(fā)酵的最佳溫度。

2.7 發(fā)酵蘿卜中NIT降解工藝正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

通過對(duì)蔗糖濃度(A)、食鹽濃度(B)、氮源添加量(C)、發(fā)酵時(shí)間(D)和發(fā)酵溫度(E)進(jìn)行單因素試驗(yàn)后，采用L16(45)正交表，以總酸和NIT含量為指標(biāo)研究5個(gè)因素協(xié)同作用下LP-7501S在發(fā)酵體系中產(chǎn)酸和降解NIT的最優(yōu)工藝。正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果見表5。

表5 正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果Table 5 The optimized results of orthogonal test

由表5中極差R1可知，5個(gè)因素中影響總酸含量的主次為發(fā)酵時(shí)間(D)>發(fā)酵溫度(E)>氮源添加量(C)>蔗糖濃度(A)>食鹽濃度(B)，最優(yōu)的產(chǎn)酸工藝為A3B3C4D4E4。根據(jù)方差分析得出發(fā)酵時(shí)間對(duì)總酸影響顯著(p<0.05)。

由極差R2可知，上述5個(gè)因素中影響NIT含量的主次為發(fā)酵溫度(E)=發(fā)酵時(shí)間(D)>氮源添加量(C)>蔗糖濃度(A)>食鹽濃度(B)，最優(yōu)的NIT降解工藝為A4B2C3D4E3，通過SPSS軟件對(duì)各因素進(jìn)行方差分析，得出發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間對(duì)NIT含量影響顯著(p<0.05)。

綜合產(chǎn)總酸和NIT含量的最優(yōu)方案，A3B3C4D4E4組合的發(fā)酵溫度較高、產(chǎn)酸量過高，可能會(huì)影響成品風(fēng)味。故選擇A4B2C3D4E3組合作為LP-7501S發(fā)酵蘿卜產(chǎn)酸和降解的最優(yōu)工藝，即0.9%蔗糖、4%食鹽、0.7%酵母抽提物、30 ℃發(fā)酵84 h，因正交表中沒有出現(xiàn)這項(xiàng)組合，因此按A4B2C3D4E3進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，測定總酸、NIT含量與感官評(píng)價(jià)，試驗(yàn)結(jié)果見表6。

表6 試驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果Table 6 The result of verification test

由表6可知，在A4B2C3D4E3的降解工藝條件下，測得發(fā)酵蘿卜中總酸含量為0.73 g/100 g，NIT含量為0.432 mg/kg，感官評(píng)價(jià)為75分。

3 結(jié)論

試驗(yàn)得出最優(yōu)發(fā)酵工藝：蔗糖添加量為0.7%，食鹽添加量為4%，氮源添加量為0.7%，發(fā)酵時(shí)間為84 h，發(fā)酵溫度為30 ℃。在此發(fā)酵工藝條件下，總酸含量為0.73 g/100 g，發(fā)酵體系中亞硝酸鹽快速降解，含量可降至更低的水平0.432 mg/kg。得出相比自然發(fā)酵，用LP-7501S進(jìn)行強(qiáng)化發(fā)酵，并采用最佳發(fā)酵工藝，可顯著降低亞硝酸鹽的含量，而且可明顯提高泡菜發(fā)酵過程中亞硝酸鹽的降解速度。此工藝條件下所得到的泡菜在保證口感脆嫩酸甜、香氣醇正的同時(shí)，具有更高的安全性。