沈帆，王麗麗，趙楊

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦科，沈陽(yáng) 110001）

卵巢上皮癌的死亡率居?jì)D科腫瘤的首位［1］。由于臨床癥狀不典型，缺乏有效的篩查手段，導(dǎo)致大多數(shù)患者就診時(shí)已近晚期。卵巢上皮癌術(shù)后易復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致預(yù)后較差［2-3］，晚期患者平均5年存活率僅約30%［4］。因此，亟需尋找治療卵巢上皮癌的有效藥物。

肌漿/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+-ATP酶（sarco/endoplasmic reticulum Ca2+ATPase，SERCA）是一種位于肌漿/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的細(xì)胞內(nèi)Ca2+泵。SERCA介導(dǎo)Ca2+從細(xì)胞質(zhì)向肌漿/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)，是維持細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵［5］。有研究［6］表明，脂肪肉瘤中SERCA2過(guò)表達(dá)能夠激活細(xì)胞存活途徑。SERCA2在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的過(guò)度表達(dá)驅(qū)動(dòng)增殖和遷移，在結(jié)直腸癌發(fā)生中起關(guān)鍵作用［7］。卵巢癌細(xì)胞中SERCA2表達(dá)水平高于正常卵巢表面上皮細(xì)胞［8］，提示SERCA2可能促進(jìn)卵巢癌的發(fā)生發(fā)展。研究［9-10］表明，抑制SERCA表達(dá)導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣儲(chǔ)存池的耗盡，并使細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平升高，可能導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體受損，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。毒胡蘿卜素是SERCA2的特異性不可逆抑制劑，通過(guò)干擾內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡［11］。本研究擬探討毒胡蘿卜素在卵巢癌細(xì)胞中的作用及其潛在作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及處理

本研究采用人卵巢癌細(xì)胞系OVCAR3和A2780。OVCAR3細(xì)胞在RPMI 1640培養(yǎng)基（美國(guó)HyClone公司）中培養(yǎng)，A2780細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)HyClone公司）中培養(yǎng)。培養(yǎng)基中添加1%青霉素/鏈霉素和10%胎牛血清。細(xì)胞在5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育。以毒胡蘿卜素濃度0.031 25～1.0 μmol/L（OVCAR3）和0.062 5～2.0 μmol/L（A2780）進(jìn)行細(xì)胞活力測(cè)定，篩選出最佳作用濃度（OVCAR3：0.062 5 μmol/L，A2780：0.25 μmol/L）進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，以加入DMSO為對(duì)照組。

1.2 細(xì)胞活力測(cè)定（MTT法）

收集并計(jì)數(shù)細(xì)胞，接種在96孔板中（3 000細(xì)胞/孔）。培養(yǎng)至細(xì)胞單層鋪滿孔底，加入不同濃度梯度的毒胡蘿卜素，同時(shí)設(shè)置對(duì)照孔。在處理后0、24、48和72 h，每孔加入20 μL MTT（5 mg/mL），孵箱中培養(yǎng)4 h。棄培養(yǎng)液，加入DMSO溶液150 μL/孔。用微孔板分光光度計(jì)（美國(guó)Bio-Tek Instruments公司）檢測(cè)各孔在波長(zhǎng)490 nm處的吸光度，計(jì)算半數(shù)抑制濃度（50% inhibitory concentration，IC50）。

1.3 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

用不含EDTA的胰蛋白酶消化細(xì)胞后，以1 500 r/min離心5 min，用冷PBS洗滌，以同樣速度再次離心。棄PBS，加入1×binding緩沖液100 μL制作細(xì)胞懸液，在避光條件下，分別加入5 μL碘化丙錠（propidium iodide，PI）和5 μL 膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（美國(guó)BD Biosciences公司），輕輕混勻并室溫孵育30 min，加入1×binding緩沖液400 μL，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞的凋亡率。

1.4 Ca2+濃度測(cè)定

收集細(xì)胞并離心，PBS洗滌2次。用無(wú)胎牛血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后，加入Fluo-3-AM（美國(guó)Biotium公司，終濃度5 μmol/L）。避光條件下，37 ℃孵育細(xì)胞30 min。離心并去除多余染料，PBS反復(fù)洗滌、離心3次。加入500 μL PBS重懸細(xì)胞后，進(jìn)行流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。

1.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

將細(xì)胞接種于6孔板中，37 ℃培養(yǎng)至80%融合。用200 μL微量加樣器槍頭垂直于6孔板劃痕，用PBS洗除劃痕產(chǎn)生的細(xì)胞碎片后，在無(wú)胎牛血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。在劃痕后0和48 h時(shí)顯微鏡下拍照。使用ImageJ軟 件（美 國(guó)National Institutes of Health）測(cè)量劃痕區(qū)域的面積。計(jì)算細(xì)胞遷移率=（原劃痕面積-不同時(shí)間點(diǎn)的劃痕面積）/原劃痕面積×100%。

1.6 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

用無(wú)血清培養(yǎng)基1 ∶10稀釋4 ℃放置過(guò)夜的基質(zhì)膠（美國(guó)Sigma-Aldrich公司），并以30 μL/孔加入Transwell小室，置于培養(yǎng)箱孵育4 h。將重懸于200 μL無(wú)血清培養(yǎng)基中的細(xì)胞接種于Transwell上室，下室加入600 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基作為趨化劑。37 ℃下孵育48 h，擦去上表面未穿透基質(zhì)膠的細(xì)胞，PBS洗2遍。4%多聚甲醛固定15 min，行結(jié)晶紫染色，用PBS洗去染料。常溫下晾干封片，倒置熒光顯微鏡（CKX53，日本Olympus公司）下拍照。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

使用TRIzol試劑（日本TaKaRa公司）提取卵巢癌細(xì)胞總RNA。使用分光光度計(jì)（中國(guó)上海Unico公司）檢測(cè)OD260nm/280nm，計(jì)算RNA濃度。按照Promega逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書，將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒（日本TaKaRa公司）擴(kuò)增cDNA。每個(gè)靶基因的表達(dá)水平以18S mRNA為內(nèi)參對(duì)照。各基因引物序列如下：SERCA2，5'-GGTGGCAACAGA ACAGG-3'，5'-CCAGGCAGGTGGTGAT-3'；CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合同源蛋白（C/EBP-homologous protein，CHOP）基 因，5'-ACTCTTGACCCTGCTTCTC-3'，5'-A GTCGCCTCTACTTCCCT-3'；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）基因，5'-TGGGACAGTAGAAAGGG-3'，5'-AAGGGAGTGG TAGCAGTA-3'；B細(xì)胞淋巴瘤2（B-cell lymphoma 2，BCL2）基因，5'-TGTGGCCTTCTTTGAGTTCG-3'，5'-CTACCCAGCCTCCGTTATCC-3'；SURVIVIN，5'-CT TGGCCCAGTGTTTCTT-3'，5'-GCTTCCAGTCCCTCC CT-3'；B細(xì)胞淋巴瘤XL（B-cell lymphoma-XL，BCL-XL）基因，5'-TTCCCAGAAAGGATACAGC-3'，5'-GG GTCTCCATCTCCGATT-3'；18S，5'-GAAACGGCTACC ACATCC-3'，5'-ACCAGACTTGCCCTCCA-3'。根 據(jù)來(lái)自3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的樣品閾值循環(huán)（Ct）分析數(shù)據(jù)。

1.8 Western blotting

使用細(xì)胞裂解液處理經(jīng)毒胡蘿卜素處理的卵巢癌細(xì)胞，蛋白定量。行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至纖維素膜（德國(guó)Amersham公司）。用3%牛血清白蛋白在室溫下封閉1.5 h，孵育一抗SERCA2、CHOP、VEGFA、BCL-2、SURVIVIN、BCL-XL（1 ∶1 000稀釋，美國(guó)Proteintech公司），4 ℃孵育過(guò)夜，抗β-actin（1 ∶2 000稀釋，美國(guó)Proteintech公司）作為內(nèi)參。次日用1×TBST洗膜3次，用山羊抗兔二抗（1 ∶5 000稀釋，中國(guó)Abbkine公司）在室溫下孵育2 h，用1×TBST洗膜3次。用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑（美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司）曝光成像。

圖1 Thapsigargin抑制卵巢細(xì)胞的增殖Fig.1 Thapsigargin inhibits proliferation of ovarian cancer cells

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。2組計(jì)量資料采用Student'st檢驗(yàn)進(jìn)行比較。所有P值均為雙側(cè)，且P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。每組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 毒胡蘿卜素抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖

MTT結(jié)果顯示，卵巢癌OVCAR3和A2780細(xì)胞分別暴露于濃度為0.031 25～1.0 μmol/L和0.062 5～2.0 μmol/L的毒胡蘿卜素后，與對(duì)照組相比，卵巢癌OVCAR3和A2780細(xì)胞的增殖能力下降，并呈劑量依賴性（P＜ 0.05），見(jiàn)圖1。

毒胡蘿卜素對(duì)OVCAR3的IC50為0.270 3 μmol/L，對(duì)A2780的IC50為0.899 4 μmol/L。在保證細(xì)胞活力的前提下，選取毒胡蘿卜素濃度分別為0.062 5 μmol/L和0.25 μmol/L對(duì)應(yīng)卵巢癌細(xì)胞系OVCAR3和A2780進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 毒胡蘿卜素可增加細(xì)胞質(zhì)中Ca2+濃度并誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示，毒胡蘿卜素能夠增加卵巢癌細(xì)胞胞質(zhì)中的Ca2+濃度（P＜ 0.05，圖2A），并能顯著誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞系OVCAR3和A2780的凋亡（P＜ 0.05，圖2B）。

2.3 毒胡蘿卜素處理后卵巢癌細(xì)胞遷移和侵襲能力下降

進(jìn)一步評(píng)估毒胡蘿卜素處理后卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力的變化，結(jié)果表明，毒胡蘿卜素能夠顯著降低卵巢癌細(xì)胞系OVCAR3和A2780的遷移和侵襲能力（P＜ 0.05，圖3、圖4）。

2.4 毒胡蘿卜素作用下卵巢癌細(xì)胞中相關(guān)基因mRNA和蛋白表達(dá)的變化

經(jīng)毒胡蘿卜素處理后，SERCA2、VEGFA、BCL-2、BCL-XL和SURVIVINmRNA和蛋白表達(dá)水平均下降，而CHOP的表達(dá)則增加（P＜ 0.05，圖5）。

3 討論

SERCA抑制劑毒胡蘿卜素是一種潛在的抑癌劑［12］。研究［13］表明，毒胡蘿卜素與洋地黃毒苷對(duì)ER陰性乳腺癌細(xì)胞具有協(xié)同抑制作用。在前列腺癌中，毒胡蘿卜素可通過(guò)激活凋亡途徑誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡［14］。此外，毒胡蘿卜素還可通過(guò)破壞人肺癌細(xì)胞的細(xì)胞骨架誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［15］。

圖3 毒胡蘿卜素處理后細(xì)胞遷移能力下降 ×40Fig.3 Thapsigargin reduces cell migration capacity ×40

本研究結(jié)果顯示，不同濃度的毒胡蘿卜素能夠降低卵巢癌細(xì)胞系OVCAR3和A2780的細(xì)胞活力，且呈劑量依賴性。同時(shí)，卵巢癌細(xì)胞系OVCAR3和A2780的增殖在毒胡蘿卜素濃度分別為0.062 5μmol/L和0.25 μmol/L時(shí)受到顯著抑制，因此，分別選取這2個(gè)濃度對(duì)應(yīng)卵巢癌細(xì)胞系OVCAR3和A2780進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。毒胡蘿卜素處理后，2種細(xì)胞的活力均降低，凋亡細(xì)胞的比例增加，遷移和侵襲能力下降。表明毒胡蘿卜素可抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，增加卵巢癌細(xì)胞的凋亡。

圖4 毒胡蘿卜素處理后細(xì)胞侵襲能力下降 ×100Fig.4 Thapsigargin reduces cell invasive capacity ×100

圖5 毒胡蘿卜素作用下卵巢癌細(xì)胞中相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)的變化Fig.5 Changes of related protein expression in ovarian cancer cells induced by thapsigargin

鈣調(diào)節(jié)泵SERCA在維持細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)中起關(guān)鍵作用，它能夠主動(dòng)將釋放的Ca2+重新積聚回肌漿內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，從而維持Ca2+穩(wěn)態(tài)。細(xì)胞內(nèi)Ca2+在控制細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和凋亡的多種信號(hào)通路中起關(guān)鍵作用［16］。胰腺癌中，Ca2+/鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶/NFAT信號(hào)通路參與癌基因c-Myc的上調(diào)轉(zhuǎn)錄機(jī)制，導(dǎo)致G1/S期轉(zhuǎn)變加速，最終促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的增殖［17］。在某些乳腺癌中，存在特定鈣可滲透離子通道的表達(dá)變化，這種變化可能在乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲性中起重要作用，甚至與乳腺癌亞型及預(yù)后有關(guān)［18］。研究［19］表明，SERCA失調(diào)引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣儲(chǔ)存池Ca2+的枯竭，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣水平上升。高胞質(zhì)水平的Ca2+能夠引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致未折疊蛋白積累，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡途徑［20］。研究發(fā)現(xiàn)，SERCA2在多種腫瘤中發(fā)揮促癌作用。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)毒胡蘿卜素處理后，卵巢癌細(xì)胞中SERCA2、BCL2、BCLXL和SURVIVINmRNA和蛋白表達(dá)水平均降低，細(xì)胞質(zhì)中Ca2+濃度增加。提示毒胡蘿卜素可有效抑制SERCA2的表達(dá)，促使Ca2+水平升高，降低抗凋亡蛋白BCL2及BCL-XL表達(dá)水平，進(jìn)而引起卵巢癌細(xì)胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和細(xì)胞凋亡。

本研究還發(fā)現(xiàn)，用毒胡蘿卜素處理卵巢癌細(xì)胞后，CHOPmRNA及蛋白表達(dá)水平升高。CHOP也稱為生長(zhǎng)停滯和DNA損傷誘導(dǎo)基因153（growth arrest and DNA damage gene 153，GADD153），是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的特定轉(zhuǎn)錄因子，在正常條件下呈低表達(dá)水平，其上調(diào)能夠誘導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)停滯和凋亡［21-22］。在胰腺癌細(xì)胞中，特異性siRNA誘導(dǎo)的CHOP表達(dá)下調(diào)顯著降低了辣椒素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［23］。因此，毒胡蘿卜素可能通過(guò)激活CHOP誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡。

VEGFA主要與2種酪氨酸激酶受體VEGFR1（Flt-1）和VEGFR2（KDR/Flk-1）結(jié)合，從而調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和血管通透性，促進(jìn)腫瘤血管生成［24］。本研究發(fā)現(xiàn)，毒胡蘿卜素可降低卵巢癌細(xì)胞VEGFA表達(dá)水平，抑制卵巢癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力，提示毒胡蘿卜素可能通過(guò)VEGFA抑制卵巢癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，毒胡蘿卜素能夠抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲轉(zhuǎn)移能力，并且可能通過(guò)調(diào)節(jié)SERCA2誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡。