陳海英，劉雨琪

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院產(chǎn)科，沈陽 110001）

深靜脈血栓形成是由于血液在深靜脈內(nèi)不正常凝結(jié)導(dǎo)致的靜脈回流障礙性疾病，常常在下肢發(fā)生［1］。血栓形成后，除少數(shù)能自行消融或局限于發(fā)生部位外，大部分會擴(kuò)散至整個(gè)肢體的深靜脈主干，若不及時(shí)診斷和處理，多數(shù)會演變?yōu)檠?，形成后遺癥，長時(shí)間影響患者的生活質(zhì)量。還有一些患者可能并發(fā)肺栓塞，造成極為嚴(yán)重的后果。妊娠期纖溶凝血系統(tǒng)特殊的生理性改變，可以減少分娩后胎盤剝離面出血和裂傷處出血，但同時(shí)也增加了動靜脈血栓形成的機(jī)會［2］。妊娠期女性發(fā)生靜脈血栓的風(fēng)險(xiǎn)是同齡女性的5倍，是導(dǎo)致孕產(chǎn)婦死亡的主要原因之一［3］。

很多研究［4］證實(shí)，高同型半胱氨酸血癥（hyperhomocystinemia，HHcy）是動靜脈血栓形成的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，HHcy也與多種不良妊娠結(jié)局關(guān)系密切，如流產(chǎn)、子癇前期、胎兒宮內(nèi)發(fā)育受限等，但HHcy是否與妊娠期靜脈血栓形成有關(guān)卻罕有報(bào)道。而且大量研究［5-6］證實(shí)了雌二醇（estradiol，E2）具有抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用，對血管內(nèi)皮細(xì)胞來說是保護(hù)性因子。E2是否與妊娠期靜脈血栓形成有關(guān)未見報(bào)道。本課題組前期研究［7］發(fā)現(xiàn)，妊娠期靜脈血栓患者血清E2水平下降而同型半胱氨酸（homocystinemia，Hcy）水平升高，推測E2和Hcy與妊娠期靜脈血栓形成有關(guān)，但其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究［7］。WILMANNS等［8］發(fā)現(xiàn)，亞甲基四氫葉酸還原酶（5，10-methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）的基因多態(tài)性與深靜脈血栓患者血清Hcy水平相關(guān)，推測Hcy促進(jìn)靜脈血栓形成的原因可能與MTHFR有關(guān)。

本研究通過觀察E2與Hcy對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）增殖和凋亡的影響，探討E2與Hcy是否為妊娠期靜脈血栓形成的保護(hù)因素與危險(xiǎn)因素；通過檢測Hcy代謝關(guān)鍵酶MTHFR的表達(dá)，探討E2對Hcy的可能調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑

HUVEC購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司，E2和Hcy購自美國Sigma公司，AnnexinⅤ-FITC/PI雙染凋亡試劑盒和CCK-8試劑盒購自中國凱基公司，RNA提取試劑盒、SYBR實(shí)時(shí)定量試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TaKaRa公司。

1.2 HUVEC的培養(yǎng)

HUVEC培養(yǎng)基是含10%胎牛血清的RPMI 1640，培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2，適時(shí)換液傳代。

1.3 CCK-8法檢測HUVEC增殖能力

將細(xì)胞分為對照組、E2組（E2濃度分為1×10-9、1×10-8、1×10-7、1×10-6μmol/L），Hcy組（Hcy濃度分為1×10-5、3×10-5、6×10-5、1×10-4μmol/L）。調(diào)整HUVEC濃度為1×104/mL，接種于96孔板，每孔接種量是100 μL，加入相應(yīng)處理因素至目標(biāo)濃度。CCK-8法檢測時(shí)間點(diǎn)分別是24、48、72 h，加入10 μL CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后應(yīng)用酶標(biāo)儀490 nm波長檢測光密度值。選取E2和Hcy作用的最適濃度，分為對照組、E2組、Hcy組和E2+Hcy組，再次應(yīng)用CCK-8法檢測培養(yǎng)24、48和72 h細(xì)胞的增殖能力。

1.4 AnnexinⅤ-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測HUVEC凋亡

應(yīng)用E2和Hcy培養(yǎng)各組細(xì)胞72 h（與1.3中的分組和最適濃度相同），收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL。應(yīng)用冷PBS吹打后，離心細(xì)胞2遍，應(yīng)用緩沖液重新懸置細(xì)胞。取出細(xì)胞懸液500 μL，分別加入5 μL AnnexinⅤ-FITC和5 μL碘化丙啶，于4 ℃中避光孵育細(xì)胞30 min，最后應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.5 實(shí)時(shí)定量PCR檢測HUVEC中MTHFR mRNA表達(dá)

應(yīng)用E2和Hcy培養(yǎng)各組HUVEC 72 h（與1.3中的分組和最適濃度相同）。應(yīng)用Traziol提取總mRNA。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的條件是37 ℃ 15 min；85 ℃ 5 s。反應(yīng)體系為12.5 μL SYBR Premix EaqTMⅡ（2×）、1 μL PCR Forward Primer（10 μmol/L）、1 μL PCR Reverse Primer（10 μmol/L）、2 μL模板cDNA、dH2O（滅菌蒸餾水），反應(yīng)總體積共25 μL。實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件是95 ℃ 30 s，1個(gè)循環(huán)；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，1個(gè)循環(huán)。MTHFR上游引物：5'-TGAAGG AGAAGGTGTCTGCGGGA-3'，下游引物：5'-AGGAC GGTGCGGTGAGAGTG-3'。

1.6 Western blotting檢測HUVEC中MTHFR蛋白表達(dá)

應(yīng)用E2和Hcy培養(yǎng)各組HUVEC 72 h（與1.3中的分組和最適濃度相同）。細(xì)胞加細(xì)胞裂解緩沖液（cat#P0013，中國Beyotime公司）破碎后提取蛋白，應(yīng)用BCA蛋白質(zhì)測定法（中國Beyotime公司）檢測蛋白質(zhì)濃度。取30 μg蛋白，使用10% Tris-甘氨酸凝膠的SDS-PAGE分離。將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜（美國Millipore公司）上，在室溫下用5%脫脂牛奶封閉。應(yīng)用鼠抗人MTHFR（1 ∶2 000，美國Abcam公司）一抗4 ℃過夜，用HRP標(biāo)記的抗鼠二抗（1 ∶10 000，中國Vazyme公司）和增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（美國Millipore公司）顯色。使用ImageJ軟件進(jìn)行光密度分析。應(yīng)用GAPDH（1 ∶5 000，美國Abcam公司）做對照，進(jìn)行半定量分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 13.0軟件對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用表示，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，計(jì)數(shù)資料采用方差分析進(jìn)行比較，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HUVEC的增殖能力

E2可以促進(jìn)HUVEC增殖，在1×10-8μmol/L濃度下作用72 h時(shí)效果最明顯，與對照組及24 h比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。Hcy能使HUVEC增殖減慢，在1×10-4μmol/L濃度下作用72 h時(shí)抑制增殖作用最明顯，與對照組及24 h比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。見表1。

將E2與Hcy以最適濃度共同加入到細(xì)胞中，分為對照組、E2（1×10-8μmol/L）組、Hcy（1×10-4μmol/L）組和E2（1×10-8μmol/L）+Hcy（1×10-4μmol/L）組。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，E2+Hcy組與Hcy組相比，24、48、72 h時(shí)細(xì)胞增殖明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。見表2。

2.2 各組細(xì)胞凋亡率

表1 不同濃度E2與Hcy作用于HUVEC不同時(shí)間的OD值Tab.1 OD values at different time points in HUVECs treated with different concentrations of E2 and Hcy

表2 最適濃度E2和Hcy作用于HUVEC不同時(shí)間的OD值Tab.2 OD values at different time points in HUVECs treated with the most suitable concentrations of E2 and Hcy

流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡情況，凋亡率對照組 為（1.59±0.07）%，1×10-9μmol/L E2組 為（1.67±0.23）%，1×10-8μmol/L E2組為（0.98±0.03）%，1×10-7μmol/L E2組 為（1.23±0.05）%，3×10-5μmol/L Hcy組為（6.22±0.40）%，6×10-5μmol/L Hcy組為（10.64±0.78）%，1×10-4μmol/L Hcy組為（16.79±1.01）%。E2組與對照組相比HUVEC凋亡受到抑制，1×10-8μmol/L E2組凋亡率明顯低于對照組（P＜ 0.05）。Hcy組與對照組相比明顯促進(jìn)HUVEC凋亡，1×10-4μmol/L Hcy組凋亡率明顯高于對照組（P＜ 0.05）。最適濃度E2（1×10-8μmol/L）和Hcy（1×10-4μmol/L）共同作用于HUVEC，凋亡率為（1.06±0.06）%，與Hcy組相比，能夠抑制Hcy誘導(dǎo)的HUVEC凋亡。見圖1。

2.3 HUVEC中MTHFR mRNA表達(dá)

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡率Fig.1 Apoptosis rate detected by flow cytometry

與對照組相比，E2組、Hcy組、E2+Hcy組MTHFRmRNA的相對表達(dá)分別為1.85±0.045、1.01±0.011、1.76±0.023，E2組、E2+Hcy組表達(dá)明顯升高（P＜0.05），Hcy組無明顯變化。

2.4 HUVEC中MTHFR蛋白表達(dá)

Western blotting結(jié)果顯示，與對照組相比，E2組、Hcy組、E2+Hcy組MTHFR的相對表達(dá)分別為1.43±0.023、1.03±0.012、1.42±0.018，E2組、E2+Hcy組表達(dá)明顯升高（P＜ 0.05），Hcy組無明顯變化。見圖2。

圖2 Western blotting檢測HUVEC中MTHFR蛋白的表達(dá)Fig.2 Expression of MTHFR protein in HUVECs detected by Western blotting

3 討論

血管內(nèi)皮細(xì)胞為襯覆于血管內(nèi)腔面的單層扁平細(xì)胞，增殖和凋亡平衡是其保持自身正常結(jié)構(gòu)和功能的基礎(chǔ)。內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡過度或增殖不足，導(dǎo)致血管壁受損，可以促進(jìn)血小板的黏附和血栓的形成，這是引起血栓的一個(gè)重要原因。妊娠期血流停滯、血液高凝狀態(tài)和血管壁損傷是妊娠期深靜脈血栓形成的主要原因，所以研究血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和凋亡的平衡，有助于揭示妊娠期靜脈血栓形成的原因，進(jìn)而提供有效防治妊娠期靜脈血栓靶點(diǎn)的理論依據(jù)。

Hcy是在蛋氨酸代謝過程中產(chǎn)生的含硫氨基酸。已在多種疾病中觀察到Hcy水平升高，如心血管疾病、動脈粥樣硬化、心肌梗死、中風(fēng)、最小認(rèn)知障礙、癡呆、帕金森病、多發(fā)性硬化、癲癇和子癇。HHcy對血管和神經(jīng)系統(tǒng)都有直接的毒性作用。近年來大量的研究已經(jīng)證實(shí)，Hcy代謝異常是血液高凝狀態(tài)形成的重要原因之一，是動靜脈栓塞性疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。HHcy導(dǎo)致血栓形成的具體致病機(jī)制尚不完全清楚，目前醫(yī)學(xué)界比較公認(rèn)的幾個(gè)機(jī)制是：破壞血管內(nèi)皮，激活血小板，活化凝血因子，抑制抗凝系統(tǒng)，破壞纖溶系統(tǒng)。歐三桃等［9］發(fā)現(xiàn)，S-腺苷Hcy可以抑制大鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能異常。本課題組前期研究［7］也證實(shí)，妊娠期靜脈血栓的患者血液中Hcy水平明顯高于正常孕婦，推測HHcy通過促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡抑制增殖，達(dá)到促進(jìn)妊娠期靜脈血栓形成的作用。本研究證實(shí)了高Hcy能夠促進(jìn)HUVEC凋亡，并抑制其增殖。

在生理?xiàng)l件下，Hcy濃度在正常妊娠期間下降［10］。妊娠期雌激素水平升高，推測作為血管保護(hù)因子，雌激素可能通過某種機(jī)制參與調(diào)控妊娠期血漿中Hcy的水平，防止妊娠期處于血栓前狀態(tài)，進(jìn)一步發(fā)展形成血栓。本研究發(fā)現(xiàn)，E2能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。E2與Hcy共同作用于HUVEC與單獨(dú)Hcy作用相比，可以明顯促進(jìn)細(xì)胞的增殖、抑制細(xì)胞的凋亡，說明E2可以有效抑制Hcy破壞血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的作用，達(dá)到防治深靜脈血栓形成的目的。

MTHFR是體內(nèi)葉酸代謝和Hcy甲基化的關(guān)鍵酶。本研究通過實(shí)時(shí)定量 PCR檢測各組細(xì)胞中MTHFR基因的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，E2可以上調(diào)HUVEC中MTHFR的表達(dá)，Hcy不增加MTHFR的表達(dá)，E2與Hcy共同作用同樣使MTHFR的表達(dá)上調(diào)。因而推測，E2可能通過調(diào)節(jié)MTHFR的表達(dá)來發(fā)揮內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)功能，抑制Hcy對臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的促凋亡功能，但其具體機(jī)制還需進(jìn)行深入研究。