康樂(lè)，陶雅軍，張媛媛，陳英杰，方明

（1.大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)部生理學(xué)與病理生理學(xué)教研室，遼寧 大連 116622；2.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科，遼寧 大連 116011）

乳腺癌是威脅全球女性生命最主要的癌癥之一。三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）是一種具有特殊分子表型的乳腺癌亞型，其惡性度高且易發(fā)生轉(zhuǎn)移，缺乏有效的治療手段，患者預(yù)后差［1］。因而，亟需探索針對(duì)TNBC的更有效的治療方法。

血管生成擬態(tài)（vasculogenic mimicry，VM）是近年來(lái)提出的一種全新的腫瘤微循環(huán)模式。不同于經(jīng)典的內(nèi)皮細(xì)胞依賴(lài)的腫瘤微血管結(jié)構(gòu)，VM是高侵襲性腫瘤細(xì)胞為了滿足自身的血供，通過(guò)自身變形和細(xì)胞外基質(zhì)重塑而形成的一種類(lèi)似血管樣的通道［2］。研究［3］顯示，TNBC中VM形成明顯高于其他乳腺癌類(lèi)型，其與TNBC的高侵襲性和轉(zhuǎn)移性密切相關(guān)，也是導(dǎo)致抗血管生成藥物療效不佳的重要原因之一。因而，探索抑制VM的方法，將為T(mén)NBC的治療提供新的思路。

microRNA-34a（miR-34a）是具有抑癌作用的微小RNA（microRNA，miRNA）之一，參與對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡、衰老等多種生命活動(dòng)的調(diào)控。近來(lái)研究［4］顯示，TNBC患者腫瘤組織中miR-34a表達(dá)水平極低，且miR-34a的低水平表達(dá)預(yù)示患者預(yù)后較差。本課題組前期研究［5］顯示，miR-34a過(guò)表達(dá)能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲和遷移活動(dòng)，但其是否參與TNBC細(xì)胞VM形成的調(diào)控目前尚無(wú)報(bào)道。本研究以TNBC細(xì)胞MDA-MB-231為研究對(duì)象，通過(guò)體外三維培養(yǎng)模型，采用基因過(guò)表達(dá)、Western blotting等方法探討miR-34a在TNBC細(xì)胞VM形成中的作用和機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231和人胚腎細(xì)胞株HEK293T（中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心），胎牛血清（美國(guó)Gibco公司），RPMI 1640培養(yǎng)基、MEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶（美國(guó)Hyclone公司），Matrigel膠（美國(guó)BD公司），磷酸鹽緩沖液（北京索來(lái)寶生物科技有限公司），Taqman?MicroRNA Reverse Transcription試劑盒（美國(guó)Applied Biosystems公司），RNA PCR試劑盒（大連寶生物工程有限公司），U6引物、miR-34a引物（美國(guó)Life Technologies公司），Trizol、轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamine 2000（美國(guó)Invitrogen公司），血管內(nèi)皮細(xì)胞鈣黏蛋白（vascular endothelial cadherin，VE-cadherin）抗體（美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司），基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix metalloprotease 2，MMP-2）抗體、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloprotease 9，MMP-9）抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（美國(guó)Cell Signaling Technology公司），E-cadherin抗體、Vimentin抗體（英國(guó)Abcam公司），miR-34a模擬物及其陰性對(duì)照（negative control，NC）、si-ZEB1及si-NC片段（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)時(shí)定量PCR：用TRIzol提取并測(cè)量細(xì)胞總RNA。使用Taqman法檢測(cè)miR-34a的內(nèi)源性表達(dá)，以U6作為內(nèi)參，測(cè)量 Ct值。以2-ΔΔCt表示miR-34a的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.2 細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染：將MDA-MB-231細(xì)胞分為NC組、miR-34a組、si-NC組和si-ZEB1組。其中NC組轉(zhuǎn)染miRNA無(wú)義序列，si-NC組轉(zhuǎn)染siRNA無(wú)義序列，miR-34a組轉(zhuǎn)染miR-34a 模擬物，si-ZEB1組轉(zhuǎn)染ZEB1siRNA。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，胰酶消化后700g離心5 min，收集細(xì)胞，調(diào)整密度接種至6孔板。以Lipofectamine 2000為轉(zhuǎn)染試劑，轉(zhuǎn)染過(guò)程按照Lipofectamine 2000說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.3 細(xì)胞的三維培養(yǎng)：將預(yù)冷的Matrigel 膠以50 μL/孔加至96孔板，小心搖動(dòng)，使之均勻分布避免產(chǎn)生氣泡。將包被好的96孔板37 ℃孵箱內(nèi)1 h固化。細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后消化重懸，以2×104/孔種于Matrigel膠上，置于37 ℃孵箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，倒置顯微鏡下觀察、拍照、計(jì)數(shù)結(jié)點(diǎn)數(shù)，取每個(gè)視野均值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 Western blotting法檢測(cè)蛋白表達(dá)水平：細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，提取各組細(xì)胞總蛋白，SDS/PAGE電泳，濕法轉(zhuǎn)移法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST洗滌3次。一抗VE-cadherin（1 ∶500）、MMP-2（1 ∶1 000）、MMP-9（1 ∶1 000）、E-cadherin（1∶1 000）、Vimentin（1∶1 000）4 ℃孵育過(guò)夜，HRP標(biāo)記二抗（1∶10 000）室溫孵育1 h，孵育結(jié)束后TBST洗滌3次，每次間隔10 min。ECL發(fā)光顯色，以GAPDH（1∶1 000）為內(nèi)參，檢測(cè)蛋白表達(dá)水平。

1.2.5 雙熒光素酶報(bào)告基因分析：將包含野生型miR-34a結(jié)合位點(diǎn)的ZEB1-wt-3'非翻譯區(qū)（untranslated region，UTR）及包含 突變后miR-34a結(jié)合位點(diǎn)的ZEB1-mut-3'UTR分別克隆入熒光素酶報(bào)告基因載體中構(gòu)建質(zhì)粒。將miR-34a模擬物或其N(xiāo)C與野生型或突變型報(bào)告基因質(zhì)粒分別共轉(zhuǎn)染入HEK293T細(xì)胞中。孵育48 h后，應(yīng)用熒光素酶檢測(cè)試劑盒檢測(cè)熒光酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 miR-34a過(guò)表達(dá)效果

miR-34a模擬物轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞48 h后，采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)miR-34a的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與NC相比，轉(zhuǎn)染miR-34a模擬物后，miR-34a表達(dá)水平上調(diào)（57.67 ± 8.74）倍（P＜ 0.05）。

2.2 過(guò)表達(dá)miR-34a對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞VM形成的影響

圖1 miR-34a過(guò)表達(dá)對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞VM形成能力的影響Fig.1 Effect of miR-34a overexpression on VM formation of MDA-MB-231 cells

MDA-MB-231細(xì)胞能夠在三維培養(yǎng)條件下形成大小不等的網(wǎng)絡(luò)樣管腔結(jié)構(gòu)。過(guò)表達(dá)miR-34a的MDA-MB-231細(xì)胞在Matrigel膠上形成的總節(jié)點(diǎn)數(shù)顯著減少（P＜ 0.05），提示miR-34a能夠顯著降低MDAMB-231細(xì)胞的VM形成能力。見(jiàn)圖1。

2.3 過(guò)表達(dá)miR-34a對(duì)VM形成相關(guān)分子標(biāo)志物表達(dá)的影響

采用Western blotting檢測(cè)2組細(xì)胞VM形成相關(guān)分子標(biāo)志物的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)miR-34a的MDA-MB-231細(xì)胞中，VM形成標(biāo)志物VE-cadherin、MMP-2及MMP-9的表達(dá)水平顯著降低（P＜ 0.05），提示過(guò)表達(dá)miR-34a能夠降低VM形成相關(guān)分子標(biāo)志物的表達(dá)水平。見(jiàn)圖2。

圖2 miR-34a過(guò)表達(dá)對(duì)VM形成相關(guān)分子標(biāo)志物表達(dá)的影響Fig.2 Effect of miR-34a overexpression on VM markers

2.4 miR-34a靶向結(jié)合ZEB1

應(yīng) 用 miRanda（http：//www.microrna.org/microrna/home.do）預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-34a與ZEB1之間存在結(jié)合位點(diǎn)（圖3A）。雙熒光素酶報(bào)告基因分析結(jié)果（圖3B）顯示，ZEB1-wt-3' UTR+miR-34a模擬物組熒光素酶活性較ZEB1-wt -3' UTR+NC組顯著下降（P＜0.05），而ZEB1-mut-3' UTR+miR-34a模擬物組熒光素酶活性與ZEB1-mut-3'UTR+NC組相比無(wú)明顯變化，證實(shí)miR-34a靶向抑制ZEB1表達(dá)。

圖3 miR-34a靶向抑制ZEB1Fig.3 miR-34a directly targets ZEB1

2.5 沉默ZEB1對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞VM形成的影響

si-ZEB1轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞后，采用三維培養(yǎng)觀察VM形成變化。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，si-ZEB1組細(xì)胞VM形成顯著下降（P＜ 0.05），提示ZEB1是參與MDA-MB-231細(xì)胞VM形成的重要調(diào)控因子。見(jiàn)圖4。

2.6 沉默ZEB1對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）過(guò)程的影響

圖4 沉默ZEB1對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞VM形成的影響Fig.4 Effect of ZEB1 silencing on VM formation of MDA-MB-231 cells

采用Western blotting檢測(cè)各組細(xì)胞EMT相關(guān)因子E-cadherin和Vimentin表達(dá)的變化。結(jié)果顯示，沉默ZEB1后，E-cadherin表達(dá)顯著增加，而Vimentin表達(dá)顯著下降（P＜ 0.05），提示沉默ZEB1可抑制MDAMB-231細(xì)胞的EMT進(jìn)程。見(jiàn)圖5。

圖5 沉默ZEB1對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞EMT過(guò)程的影響Fig.5 Effect of ZEB1 silencing on EMT in MDA-MB-231 cells

3 討論

TNBC是臨床上最具侵襲性的乳腺癌亞型之一。盡管TNBC的診斷和治療已有較大進(jìn)展，但由于該病易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，患者預(yù)后極差。VM是高侵襲性腫瘤細(xì)胞相互連接而形成的一種血管樣通道。它能夠?yàn)槟[瘤細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)支持，使其獲得更具侵襲性的表型，并能將腫瘤細(xì)胞帶入微循環(huán)，從而轉(zhuǎn)移到其他器官［6］。多項(xiàng)研究證實(shí)，VM形成是促進(jìn)TNBC腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移的重要因素。

miRNA是一類(lèi)長(zhǎng)約18×103～22×103的非編碼小RNA，它們能夠誘導(dǎo)靶mRNA降解或抑制靶mRNA翻譯，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)。一部分miRNA具有癌基因或抑癌基因的功能，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，miRNA與腫瘤VM形成的調(diào)控密切關(guān)聯(lián)。LI等［7］報(bào)道m(xù)iR-141能夠通過(guò)抑制EphA2的表達(dá)抑制膠質(zhì)瘤的VM形成，WAN等［8］報(bào)道m(xù)iR-124能夠通過(guò)靶向AmotL1在頭頸部腫瘤中抑制VM形成。miR-34a是一種能夠抑制腫瘤新生血管形成的miRNA［9］，但其是否參與腫瘤細(xì)胞VM形成尚無(wú)研究報(bào)道。本研究以TNBC細(xì)胞MDAMB-231為研究對(duì)象，通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)miR-34a能夠顯著抑制MDA-MB-231細(xì)胞的VM形成，提示miR-34a可能為抑制TNBC細(xì)胞VM形成的重要因子。

越來(lái)越多的證據(jù)表明，EMT過(guò)程可以通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞的可塑性、重塑細(xì)胞外基質(zhì)等機(jī)制促進(jìn)VM形成，在惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移和VM形成中起到關(guān)鍵性作用［10］。ZEB1是參與EMT調(diào)控的關(guān)鍵因子。臨床研究［11］發(fā)現(xiàn)，ZEB1高表達(dá)可作為預(yù)示TNBC患者低生存率的獨(dú)立預(yù)后因子。近期研究發(fā)現(xiàn)，ZEB1參與腫瘤細(xì)胞的VM形成。LIU等［12］的結(jié)腸直腸癌研究結(jié)果顯示，VM陽(yáng)性的樣本中ZEB1表達(dá)上調(diào)且與EMT特征相關(guān)。敲低ZEB1能夠減少VM形成，恢復(fù)腫瘤細(xì)胞的上皮表型，并抑制腫瘤的侵襲和遷移。本研究在TNBC細(xì)胞MDA-MB-231中觀察到，沉默ZEB1能夠顯著減少VM形成，同時(shí)抑制腫瘤細(xì)胞的EMT過(guò)程，提示EMT調(diào)控關(guān)鍵因子ZEB1可作為抑制TNBC細(xì)胞VM形成的重要靶點(diǎn)。生物信息學(xué)分析顯示，ZEB1是miR-34a的靶基因，且雙熒光素酶報(bào)告基因分析結(jié)果顯示，miR-34a能夠靶向抑制ZEB1的表達(dá)。因此推測(cè)，miR-34a抑制TNBC細(xì)胞VM形成的機(jī)制可能與其靶向抑制ZEB1，抑制腫瘤細(xì)胞EMT過(guò)程有關(guān)。

綜上所述，本研究首次發(fā)現(xiàn)miR-34a能夠抑制TNBC細(xì)胞的VM形成，其機(jī)制可能與靶向ZEB1抑制EMT過(guò)程有關(guān)。本研究將為T(mén)NBC中抑制VM的治療策略提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。