譚昭，劉乙臻，王琳源，關(guān)寧，高秀秋

（錦州醫(yī)科大學(xué) 1.附屬第二醫(yī)院牙周黏膜科，遼寧 錦州 121000；2.附屬第一醫(yī)院腦與脊髓損傷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 錦州 121001）

慢性牙周炎是由牙周菌斑微生物引起的炎癥性疾病，其特點(diǎn)是牙周結(jié)締組織破壞和牙槽骨吸收［1-2］。慢性重度牙周炎是慢性牙周炎最為嚴(yán)重的一類，臨床以牙周基礎(chǔ)治療作為最常規(guī)有效的治療方法，但手術(shù)治療后牙周組織仍有炎癥，無法從根本上治愈［3］。因此，研究慢性重度牙周炎的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制，尋求治療新方法是目前急需解決的問題。研究人員在慢性重度牙周炎患者的牙齦組織中發(fā)現(xiàn)大量的巨噬細(xì)胞浸潤［4-5］。巨噬細(xì)胞作為執(zhí)行先天免疫的效應(yīng)細(xì)胞，在牙周炎宿主對病原體的免疫應(yīng)答中起重要作用［6-7］。巨噬細(xì)胞由不同亞型的復(fù)雜細(xì)胞群組成，M2型巨噬細(xì)胞具有抑炎、抗寄生蟲感染和組織修復(fù)的作用［8］。然而，在慢性重度牙周炎的病損組織M2巨噬細(xì)胞如何表達(dá)，在其病程進(jìn)展中發(fā)揮怎樣的作用，目前國內(nèi)尚未完全展開此類研究。本研究旨在通過檢測M2巨噬細(xì)胞相關(guān)因子精氨酸酶Ⅰ（arginase1，Arg1）和STAT6在慢性重度牙周炎病損組織中的的表達(dá)情況，探討M2巨噬細(xì)胞在慢性重度牙周炎的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

Marker（美國賽默飛公司）；STAT6 Antibody（美國Cell Signaling公司）；Arg1 Antibody（美國Cell Signaling公司）；β-actin Antibody（中國Bioss公司）；Rabbit Antibeta-Actin（Loading Control）（中國Bioss公司）；BCA蛋白測定試劑盒（增強(qiáng)型）（中國鼎國昌盛公司）；PVDF膜（美國GE公司）；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（中國碧云天公司）；麗春紅染色液（中國碧云天公司）；HiScript?ⅡOne Step RT-PCR Kit（中 國Vazyme公 司）；100 bp DNA Ladder Marker（日本TaKaRa公司）；Trizol（美國Ambion公司）；STAT6引物合成（中國鼎國昌盛公司）；Arg1引物合成（中國鼎國昌盛公司）；DEPC水（中國鼎國昌盛公司）。

1.2 牙齦組織樣本

收集2018年6月至12月于錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院牙周科與口腔頜面外科門診被診斷為重度牙周炎且無保留意義需要拔除的患牙15例，將患牙牙齦組織樣本作為實(shí)驗(yàn)組，收集15例埋伏阻生需要拔除的患牙，取阻生牙冠方覆蓋的健康牙齦組織作為對照組［9］。慢性重度牙周炎納入標(biāo)準(zhǔn)：均符合中重度牙周炎診斷標(biāo)準(zhǔn)；口腔中剩余的牙齒≥20。排除標(biāo)準(zhǔn)：患有全身性疾病；有食物和藥物過敏史；過去1年內(nèi)進(jìn)行過牙周治療；最近2個月內(nèi)服用過抗生素、非甾體類抗炎藥和免疫抑制類藥物；孕婦或正在使用避孕藥的女性。所有患者簽署知情同意書。本研究經(jīng)錦州醫(yī)科大學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.3 實(shí)時PCR檢測

1.3.1 總RNA提?。篢RIzol法提取牙齦組織中的總RNA。紫外分光光度計(jì)測量RNA濃度，測定光密度（optical density，OD）值（260～280 nm均在1.8～2.2），記錄提取的總RNA濃度。操作完成后，凍存于-80 ℃冰箱或直接進(jìn)行PCR反應(yīng)。

1.3.2 實(shí)時PCR反應(yīng)：按照一步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒 配置25 μL反應(yīng)體系，加入反應(yīng)體系中RNA的量約為300 ng。反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA進(jìn) 行PCR擴(kuò) 增。引物設(shè)計(jì)為Arg1引物序列：上游引物序列5'-CAAGGTGGCAGAAGTCAAG -3'，下游引物序列5'-GTCCAGTCCGTCAACATCAA-3'，擴(kuò)增目的基因片段長度為466 bp。STAT6引物序列：上游引物序5'-GCCAAAGCCCTAGTGCTGAA-3'，下游引物序列5'-GACGAGGGTTCTCAGGACTTC-3'，擴(kuò)增目的基因片段長度為231 bp。以β-actin為內(nèi)參照物，上游引物序5'-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3'，下游引物序列5'-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3'，擴(kuò)增目的基因片段長度為285 bp引物均由北京鼎國昌盛生物科技有限公司合成。反應(yīng)條件為94 ℃ 5 min；35個PCR循環(huán)（94 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min）；最后72 ℃延伸7 min。瓊脂糖凝膠電泳分析：PCR反應(yīng)產(chǎn)物10 μL，上樣緩沖液1 μL，充分混勻后經(jīng)2 %瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)內(nèi)掃描，以β-actin的灰度值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)校正，計(jì)算Arg1和STAT6產(chǎn)物的相對量。

1.4 Western blotting檢測

取適量牙齦組織，放入1.5 mL的EP管中，做好標(biāo)記，加入150 μL裂解液，小剪刀盡量剪碎至無組織碎片，按照裂解液∶蛋白酶制劑=100 ∶1的比例，加入1.5 μL蛋白酶抑制劑，靜置冰上30 min，每隔5 min渦旋1次，高速離心，4 ℃ 12 000 r/min離心25 min，取上清液至新EP管中（切勿吸到下層沉淀）。用BCA蛋白試劑盒測定蛋白濃度，經(jīng)蛋白定量后按20 μg/孔行10%聚丙烯酰胺（10 %SDS-PAGE）電泳并經(jīng)濕式轉(zhuǎn)膜、洗膜、封閉（含5 %脫脂奶粉的TBST液），取一抗稀釋液（TBST液）按照1 ∶1 000稀釋Arg1和STAT6抗體，4 ℃搖床過夜；洗膜后，再加入按照1 ∶10 000稀釋的二抗，室溫振搖孵育2 h，充分洗膜，用ECL法顯影、曝光后測量X線膠片上條帶密度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0 對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)時PCR結(jié)果

通過實(shí)時PCR比較健康對照組和慢性重度牙周炎組M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)因子Arg1、STAT6的mRNA表達(dá)差異。在健康牙齦組織和慢性重度牙周炎病損組織中均有不同程度Arg1、STAT6mRNA的表達(dá)，并且慢性重度牙周組Arg1、STAT6的mRNA的表達(dá)水平顯著高于健康對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖1，表1。

2.2 Western blotting 檢測結(jié)果

Western blotting 檢測健康牙周組織和慢性重度牙周炎病損組織Arg1和SATA6蛋白表達(dá)情況。在健康牙周組織和慢性重度牙周炎病損組織中均有Arg1和STAT6蛋白表達(dá)。與健康對照組相比，慢性重度牙周炎組中Arg1和STAT6蛋白表達(dá)水平增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.01），見圖2、表2。

圖1 2組中Arg1、STAT6mRNA的表達(dá)Fig.1 The mRNA expression of Arg1and STAT6 in the two groups

圖2 2組中Arg1、STAT6的蛋白表達(dá)Fig.2 The protein expression of Arg1 and STAT6 in the two groups

3 討論

慢性重度牙周炎是一種以牙周組織破壞性為特征的慢性炎癥性疾?。?0-12］。近年研究［13］表明，慢性重度牙周炎進(jìn)展可能與巨噬細(xì)胞密切相關(guān)。牙齦組織中的巨噬細(xì)胞作為宿主免疫的重要組成部分通過與牙周微生物相互作用，分泌大量的促炎細(xì)胞因子和趨化因子激活適應(yīng)性免疫，參與牙周致病微生物的吞噬和炎癥的產(chǎn)生。

巨噬細(xì)胞在多種細(xì)胞因子的影響下，可激活成替代活化的M2型。M2型巨噬細(xì)胞可以通過分泌抑制性細(xì)胞因子下調(diào)免疫應(yīng)答，在組織愈合過程中分泌細(xì)胞外基質(zhì)促進(jìn)纖維變性和創(chuàng)傷修復(fù)。研究［14］表明，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和STAT6的磷酸化在巨噬細(xì)胞M2極化過程中具有重要作用。岳原亦等［15］研究發(fā)現(xiàn)，STATs的活化在M2型巨噬細(xì)胞極化過程中占有不可忽視的地位。MISHRA等［16］研究發(fā)現(xiàn)，野生型裸鼠的巨噬細(xì)胞M2極化水平比缺失了STAT6的實(shí)驗(yàn)裸鼠上升。SANSON等［17］研究表明，在M2型巨噬細(xì)胞發(fā)生極化的過程中，高密度脂蛋白誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞內(nèi)的STAT6激活。CZIMMERER等［18］研究發(fā)現(xiàn)在巨噬細(xì)胞M2極化過程中，活化的STAT6磷酸化抑制了調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄程序啟動子的表達(dá)。李連軍等［19］通過抑制STAT6磷酸化，從而抑制巨噬細(xì)胞分化為M2型，證實(shí)STAT6磷酸化是該過程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)途徑。

表1 2組中Arg1、STAT6 mRNA的表達(dá)及比較（）Tab.1 Comparison of the mRNA expression of Arg1 and STAT6 in the two groups（）

表1 2組中Arg1、STAT6 mRNA的表達(dá)及比較（）Tab.1 Comparison of the mRNA expression of Arg1 and STAT6 in the two groups（）

表2 2組中Arg1、STAT6蛋白的表達(dá)及比較（）Tab.2 Comparison of the protein expression of Arg1 and STAT6 in the two groups（）

表2 2組中Arg1、STAT6蛋白的表達(dá)及比較（）Tab.2 Comparison of the protein expression of Arg1 and STAT6 in the two groups（）

此外，Arg1 是M2型巨噬細(xì)胞釋放的一種是位于細(xì)胞質(zhì)中的穩(wěn)定親水性蛋白，具有抗炎、促進(jìn)組織修復(fù)的作用。Arg1生成的鳥氨酸能夠轉(zhuǎn)化成多胺來調(diào)節(jié)創(chuàng)傷、愈合和細(xì)胞的增殖，Arg1還可以與iNOS競爭性地結(jié)合底物精氨酸，促進(jìn)細(xì)胞分裂和膠原的形成，在炎癥后期對由病原微生物造成的組織損傷進(jìn)行修復(fù)和重塑［20-21］。研究［22］發(fā)現(xiàn)，在侵襲性牙周炎患者牙周組織中Arg1表達(dá)降低，SAWANO等［23］也證實(shí)了這個觀點(diǎn)，并發(fā)現(xiàn)Arg1具有促進(jìn)血管生長和修復(fù)、重構(gòu)損傷組織的功能。韓倩倩等［24］通過分析牙齦組織中Arg1表達(dá)的變化，明確了炎癥相關(guān)因子Arg1在牙周炎的慢性炎癥過程中的重要作用。本研究結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組重度慢性牙周炎病損組織中Arg1、STAT6的mRNA和蛋白表達(dá)水平高于對照組，表明M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)因子Arg1、STAT6參與了慢性重度牙周炎病損組織的修復(fù)。在健康牙齦組織中也發(fā)現(xiàn)了Arg1、STAT6的存在，提示 M2型巨噬細(xì)胞在維持組織的穩(wěn)態(tài)中也具有關(guān)鍵性作用。

綜上所述，在健康牙周組織和慢性重度牙周炎病損組織中均存在M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子Arg1和STAT6的表達(dá)，并且慢性重度牙周炎病損組織中M2型巨噬細(xì)胞細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)顯著高于健康牙周組織，表明在慢性重度牙周炎中M2型巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)增強(qiáng)。但關(guān)于M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)因子Arg1、STAT6在慢性重度牙周炎中的具體作用機(jī)制還有待研究。