韓娟娟，趙師銳，張新安

（沈陽體育學院運動人體科學學院運動生理生化教研室，沈陽 110102）

胃癌是全球第四大常見癌癥之一，其死亡率居全球癌癥第二位，發(fā)病機制復雜且預后極差［1］?，F行的手術治療、化療和放療療效一般，胃癌防治策略研究迫在眉睫。多巴胺（dopamine，DA）作為重要的神經遞質，在胃組織中大量存在，與認知、情緒、應激和運動有關［2］。血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）被認為是惡性腫瘤中最重要的血管生成細胞因子［3］。研究［4］證實外源性DA可通過抑制血管生成導致腫瘤細胞凋亡，具有明顯的抗腫瘤活性作用。運動與多巴胺能系統密切相關，游泳運動可以提高肝癌模型大鼠的DA水平，通過多巴胺D2受體（dopamine 2 receptor，D2R）顯著抑制肝癌的生長和肺轉移，延長生存時間［4-5］?；谏鲜鲅芯楷F狀，本研究假設運動可能通過調節(jié)多巴胺能系統和腫瘤血管生成抑制胃腫瘤的生長，DA和運動干預可能有較好的抗腫瘤效應。本研究分析了DA和游泳運動對N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍（N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine，MNNG）誘 導的胃癌大鼠生存率、腫瘤組織DA、血清DA及VEGF水平的影響，為胃癌的防治及術后康復提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

160只4周齡雄性Wistar大鼠購自中國醫(yī)科大學動物中心，體質量60～70 g。LC-6A型高效液相色譜儀（日本島津公司）；TZD-CL-200S化學發(fā)光免疫分析儀（廈門天中達公司）；MNNG（日本東京化成工業(yè)株式會社）；鹽酸多巴胺、多潘立酮、高氯酸、谷胱甘肽、乙二胺四乙酸二鈉、氫氧化鉀和氯化鉀、二甲基亞砜（美國Sigma-Aldrich公司）；ELISA試劑盒（上海市恒遠生物科技公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制作：所有Wistar大鼠先進行1周的適應性游泳訓練，游泳水槽體積 60 cm×50 cm×50 cm，水深25 cm，水溫34 ℃左右，環(huán)境溫度為（22±4.1）℃，光照周期12 h ∶12 h，濕度55%±4%。二甲基亞砜作為溶劑，將MNNG配成20 %的溶液，加蒸餾水稀釋至80 mg/L，置于4℃冰箱中避光保存，將MNNG溶液作為160只4周齡雄性Wistar大鼠的日常飲用水，持續(xù)28周，然后停止MNNG溶液喂養(yǎng)，飲用正常蒸餾水持續(xù)22周，共50周。隨機選取并標記10只大鼠，用于造模及成瘤分析，10只標記大鼠無死亡情況，采用頸椎脫位的方式處死標記大鼠，發(fā)現8只大鼠出現胃腫瘤（腫瘤發(fā)生率80%），分離腫瘤組織后用微卡尺測量腫瘤大小，腫瘤體積（1.56±0.47）mm（按腫瘤直徑計算），提示造模成功，可進行后續(xù)實驗。

1.2.2 大鼠分組及干預方案：將剩余存活的129只（造模過程中死亡21只）MNNG誘導50周的Wistar胃癌大鼠稱重，選取體質量相差在9.5 g以內的100只大鼠，隨機分為A、B組（每組50只）。A、B 2組再分別隨機分為5組（每組10只）：腫瘤對照（Ca）組、游泳組（Sw）、DA組、DA+多潘立酮（DA+DP）組、游泳+DA（Sw+DA）組。Ca組不進行特殊干預，正常飲食休息，Sw組每天進行2次共60 min（中間休息5 min）的游泳運動，每周運動5 d。DA組每天腹腔注射DA（50 mg/kg）。DA+DP組在DA注射前給予多潘立酮（10 mg/kg，灌胃）。Sw+DA組每天游泳后注射DA。大鼠每次游泳運動結束后均及時吹干，避免著涼。觀察A組大鼠的死亡情況，每天記錄死亡數量，直到A組大鼠全部死亡，用于生存率分析。B組干預6周后，用靜脈穿刺法抽取血液，處死所有存活大鼠，分離胃腫瘤組織冷藏備用，用于測定血清DA、VEGF水平、腫瘤組織DA水平以及腫瘤體積變化情況。本研究實驗動物的利用符合中國醫(yī)科大學動物倫理委員會的規(guī)定。

1.2.3 DA水平測定：采用高效液相色譜-電化學檢測法對血清和胃腫瘤組織進行DA檢測。將腫瘤組織稱重，加入10.2 mL的0.6 mol/L高氯酸中勻漿，高氯酸中含有1.7 mg/mL乙二醇四乙酸和1.1 mg/mL還原性谷胱甘肽，0 ℃ 2 500g離心15 min，上清1.0 mL，加入6 mol/L氫氧化鉀調pH至8.6，分批萃取后進行DA濃度測定。在25 μL氯化鉀（3 mol/L）中加入200 μL高氯酸（0.2 mol/L）洗脫液，離心，取上清液，將50 μL上清液注入高效液相色譜系統。抽取后的血液立即置于真空促凝采血管中，4 ℃冷藏柜保存1 h后離心（3 000 r/min，15 min）取200 μL血清放入勻漿器，加入200 μL流動相和10 μL蛋白沉淀劑復溶，渦旋混合后，高速離心（12 000 r/min）10 min，取上清液，進樣50 μL。在上清液中，DA的靈敏度極限為0.01 ng/mL，定義為基線噪聲的2倍，如果濃度低于靈敏度極限，DA的濃度賦值為0。

1.2.4 血漿VEGF水平檢測：血樣以800 r/min，4 ℃離心30 min，3 000 r/min離心10 min，收集血漿，80 ℃保存，根據制造商的方案，采用ELISA法測定血漿VEGF水平。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 DA和游泳運動對胃癌大鼠生存率的影響

63 d DA和游泳運動干預后，Sw+DA組生存率明顯高于Ca組，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。見圖1。

2.2 DA和游泳運動對胃癌大鼠腫瘤生長情況、腫瘤組織DA水平、血清DA和 VEGF水平的影響

圖1 胃癌大鼠生存率變化情況Fig.1 Changes in survival rates in rats with gastric cancer

42 d DA和游泳運動干預后，與Ca組大鼠比較，DA、Sw+DA組大鼠胃腫瘤體積明顯縮小，血清和腫瘤組織DA水平明顯升高（均P＜ 0.05），Sw、DA、Sw+DA組大鼠血清VEGF水平明顯降低（P＜ 0.05）；與Sw組比較，DA、Sw+DA組腫瘤體積明顯縮小，血清和腫瘤組織DA水平明顯升高（均P＜ 0.05），Sw+DA組血清VEGF水平明顯降低（P＜ 0.05）；與DA組比較，DA+DP組腫瘤體積明顯增大，血清和腫瘤組織DA水平明顯降低，VEGF水平明顯升高（均P＜ 0.05），而Sw+DA組結果相反，腫瘤體積縮小，DA水平升高，VEGF水平降低（均P＜ 0.05）。見表1。

2.3 單一游泳運動、DA及游泳運動對胃癌大鼠血清DA、VEGF水平的長期影響

與基線比較，單一游泳運動后VEGF水平逐漸降低，42 d時出現統計學差異（P＜ 0.05）；DA及游泳運動干預后，與基線比較，DA水平逐漸升高，14 d、28 d、42 d時出現統計學差異（均P＜ 0.05），VEGF水平逐漸降低，28 d、42 d時出現統計學差異（均P＜0.05），見圖2。

3 討論

胃癌生存率低且預后極差，是全球癌癥死亡的主要原因之一［6］，由于該病的早期無特異性癥狀，多數患者確診時已處于晚期，目前治療方法主要是手術及術后放、化療且療效一般［7］，有關胃癌的防治策略研究一直是學者關注的重點。

表1 DA和游泳運動對各組大鼠腫瘤體積、DA、VEGF水平的影響（n=10）Tab.1 Effects of dopamine and swimming on tumor volume，DA，and VEGF levels of rats in each group（n=10）

圖2 游泳、DA及游泳對血清DA、VEGF水平的階段性影響Fig.2 Effects of swimming or DA treatment combined with swimming on serum DA and VEGF levels

DA是一種安全有效的藥物，外源性DA可通過D2受體抑制腫瘤細胞增殖［8］，廣泛應用于食管癌、胃癌等消化系統腫瘤中，具有明顯的抗腫瘤活性作用［4］。DA主要通過5種不同的G蛋白偶聯受體亞型對靶細胞發(fā)揮作用，根據其藥理特性分為D1和D2類受體，D1類包括D1R和D5R，D2類包括D2R、D3R和D4R［9］。內源性DA在調節(jié)胃的生理機能中發(fā)揮重要作用，如減少胃酸分泌、刺激碳酸氫鹽產生和黏液的分泌。研究［2，10］發(fā)現，D2R與腫瘤有關，在人類胃癌、膀胱癌和肝癌細胞中，DA和D2R水平明顯降低，DA與癌癥呈負相關。腫瘤血管生成對實體腫瘤的生長和發(fā)展至關重要，VEGF被認為是惡性腫瘤中最重要的血管生成細胞因子［3］，且受到D2受體的調控，VEGF過表達與腫瘤生長、微血管密度、增殖、轉移及預后有關［11］。研究［12］表明，VEGF及其受體VEGFR-2介導的血管生成信號傳導通路在胃癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。DA 主要通過D2R抑制VEGF，進而抑制腫瘤組織血管生成和癌細胞的發(fā)展轉移，最終提高機體的生存率［4］，本研究通過MNNG誘導建立雄性Wistar大鼠胃癌模型，采用腹腔注射DA和多潘立酮灌胃的方式干預6周，發(fā)現DA可上調胃癌大鼠血清和癌組織中的DA水平，降低VEGF水平，多潘立酮幾乎完全阻斷了DA對胃癌的抑制作用，表明DA可通過D2R特異性地抑制VEGF介導的血管生成，抑制胃癌細胞的增殖，誘導腫瘤細胞凋亡，最終提高其生存率。

近年來，運動療法在癌癥預防和術后康復中逐漸受到重視，運動不但可以減少不同類型惡性腫瘤的發(fā)病風險，還能抑制腫瘤增殖和轉移，延長生存時間［13-15］。研究［4］發(fā)現，運動對腫瘤的抑制作用可能與多巴胺能系統有關，運動通過激活腫瘤細胞D2R信號，使得外周血中DA水平上調，最終抑制癌細胞的發(fā)生和轉移。另外，運動可以下調結直腸癌、乳腺癌、肺癌VEGF表達，抑制腫瘤血管生成，促進腫瘤細胞凋亡［16-17］。因此推測運動可能通過調節(jié)多巴胺能系統和腫瘤血管生成來抑制胃癌發(fā)展，DA及運動干預可能是胃癌防治的有效策略。本研究結果顯示，DA及運動共同作用可提高胃癌大鼠DA水平，降低VEGF水平，抑制胃癌細胞的增殖，誘導腫瘤細胞凋亡，有效延長胃癌大鼠的生存時間。單一DA療法可上調胃癌大鼠DA水平，下調胃癌大鼠VEGF水平，提高生存率，但效果低于運動與DA的共同作用。單一游泳運動可降低胃癌大鼠血清VEGF水平，但對大鼠的生存率和DA水平無影響，說明游泳運動對抑制胃癌血管形成有一定作用，但對抑制胃癌大鼠腫瘤組織生長、提高生存時間作用不明顯。DA與游泳運動共同作用比單純DA、游泳運動對胃癌有更強的抑制作用，提示運動可作為胃癌治療的輔助手段，可加強DA對胃癌的抑制。此外，為了分析DA及運動對胃癌大鼠血清DA和VEGF水平的長期影響，分別在基線、7 d、14 d、28 d、42 d檢測了大鼠血清DA和VEGF水平，發(fā)現單純游泳運動持續(xù)降低胃癌血清VEGF水平，但對血清DA水平影響不明顯。運動與DA共同作用對血清DA和VEGF水平有持續(xù)影響，可升高血清DA水平（14 d起效），降低血清VEGF水平（24 d起效）。

本研究發(fā)現，DA及其受體D2R可抑制胃癌大鼠血管生成，證明了DA作為胃癌藥物治療的可行性，D2R可能作為一個新的胃癌治療的潛在靶點，值得深入研究。本研究中，雖然單一游泳運動對胃癌大鼠DA和腫瘤生長未產生明顯影響，但運動干預作為一種輔助治療方式，值得在腫瘤防治中深入探索。

綜上所述，DA及運動干預可抑制胃癌大鼠腫瘤細胞的發(fā)生發(fā)展，提高其生存率。其效果優(yōu)于單一的DA注射或者運動干預，運動可能作為一種有效的胃癌藥物治療輔助手段。DA可通過D2R特異性地抑制VEGF介導的血管生成，誘導腫瘤細胞凋亡，DA及其受體D2R可作為胃癌治療新的潛在靶點，值得進一步探索。