李玉紅，郝明媛，焦連麗，王愛欣，任琦，馮福民

（1.華北理工大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院河北省煤礦衛(wèi)生與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 唐山 063210；2.呼倫貝爾市傳染病醫(yī)院檢驗(yàn)科，內(nèi)蒙古 呼倫貝爾 162650）

標(biāo)準(zhǔn)短程化療仍是目前抗結(jié)核治療的最有效方法。抗結(jié)核藥物性肝損傷（anti-tuberculosis drug induced liver injury，ADLI）是化療期間最常見的不良反應(yīng)，常導(dǎo)致治療間斷，嚴(yán)重者可致肝衰竭甚至死亡［1-2］。ADLI作用機(jī)制復(fù)雜，迄今尚未闡明。近來，研究者提出一個(gè)藥物性肝損傷（drug induced liver injury，DILI）發(fā)病機(jī)制的重要假說，即炎癥和藥物暴露的相互作用［3］。

細(xì)胞焦亡（pyroptosis）學(xué)說是目前炎癥反應(yīng)機(jī)制研究的新熱點(diǎn)。pyroptosis是一種促炎的程序性死亡方式，其主要依賴于炎性半胱天冬氨酸蛋白酶（cysteine-aspartic acid protease 1，Caspase-1）的活化，進(jìn)而介導(dǎo)白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1 β 活化、IL-18 分泌，并誘發(fā)級(jí)聯(lián)放大的炎癥反應(yīng)，最終誘導(dǎo)細(xì)胞炎性死亡［4］。研究［5］發(fā)現(xiàn)，在熱應(yīng)激誘導(dǎo)大鼠肝損傷模型中，熱應(yīng)激可刺激炎性體的激活，最終導(dǎo)致Caspase-1活化和IL-1β分泌，證明IL-1β參與了急性肝損傷過程。IL-1β和IL-18 炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生被認(rèn)為是pyroptosis發(fā)生的重要指標(biāo)，但目前缺乏ADLI患者中的IL-1β和IL-18水平的臨床研究。因此，本研究探討IL-1β與IL-18在ADLI 患者血清中的變化，以期為ADLI 早期抗炎干預(yù)治療提供臨床依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

選取2016年1月至2017年1月于唐山市第四醫(yī)院接受標(biāo)準(zhǔn)短程化療的初治肺結(jié)核患者。肺結(jié)核的診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)《肺結(jié)核的診斷和治療指南》［6］，ADLI的診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù) 《國(guó)際共識(shí)會(huì)議標(biāo)準(zhǔn)》［7］，即丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）＞2倍的正常值上限（upper limit of normal value，ULN），或天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）和總膽紅素（total bilirubin，TBIL）聯(lián)合升高，且其中之一升高＞2×ULN。具有以下任何一項(xiàng)的患者不納入本研究：（1）基線肝功能異常者；（2）患有可引起肝功能異常的其他疾病者（如病毒性肝炎、自身免疫型肝炎、酒精性肝病、脂肪肝、菌血癥、充血性心力衰竭等）；（3）服用其他可引起肝功能異常的藥物者。符合ADLI 標(biāo)準(zhǔn)的患者為病例組，對(duì)每個(gè)ADLI病例，按照年齡、性別、治療史、藥物劑量和方案匹配的原則選擇1個(gè)非ADLI（non-ADLI）患者作為對(duì)照。本研究獲得華北理工大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并經(jīng)患者知情同意，所采集的標(biāo)本僅用于醫(yī)學(xué)研究。

1.2 主要試劑和儀器

ELISA試劑盒購(gòu)自艾美捷科技有限公司生產(chǎn)，全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，HITACHI 7600-020全自動(dòng)生化分析儀購(gòu)自日本日立公司；Heraeus高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Thermo公司。

1.3 血清標(biāo)本的選擇

ADLI組為服用抗結(jié)核藥后，臨床檢測(cè)肝功能指標(biāo)異常，且達(dá)到診斷ADLI標(biāo)準(zhǔn)的血清標(biāo)本；非ADLI組為服用抗結(jié)核藥，與ADLI組用藥時(shí)間相匹配且未發(fā)生肝損傷的血清標(biāo)本。

1.4 檢測(cè)方法

采集患者清晨空腹外周靜脈血5 mL，4 ℃ 3 000 r/min離心分層提取血清；全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)肝功能情況；采用酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbentassay，ELISA）檢測(cè)IL-1β及IL-18 的水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，本研究中連續(xù)變量均不符合正態(tài)性分布，用M（P25～P75）表示，采用秩和檢驗(yàn)Mann-WhitneyU試驗(yàn)進(jìn)行分析；分類變量用例數(shù)（構(gòu)成比）表示，用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行分析；應(yīng)用Spearman等級(jí)相關(guān)分析評(píng)價(jià)變量之間的相關(guān)性；受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線下面積（area under the curve，AUC）用來評(píng)估IL-1β的診斷價(jià)值，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料

病例組共41例ADLI患者，其中，男31例，女10例，平均年齡31（24～51）歲，年齡范圍20～78歲；對(duì)照組共41例非肝損傷患者，其中，男31例，女10例，平均年齡33（24～51）歲，年齡范圍19～79歲。由于匹配設(shè)計(jì)的要求，2組性別和年齡的分布無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.01），2組在文化程度、職業(yè)、吸煙、飲酒、居住環(huán)境因素方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05），見表1。

2.2 2組患者肝功能水平比較

血清中AST、ALT、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）水平在ADLI組和非ADLI組中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜ 0.05），見表2。

2.3 2組患者血清IL-1β與IL-18 水平比較

血清IL-1β 在ADLI組和非ADLI組中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.01），血清IL-18在2組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見表3。

2.4 2組患者血清IL-1β與肝功能指標(biāo)的相關(guān)性分析

進(jìn)一步對(duì)研究對(duì)象血清IL-1β水平與肝功能指標(biāo)水平進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)血清IL-1β與AST、ALT及ALP呈正相關(guān)（均P＜ 0.05），且與ALT、AST相關(guān)性更顯著（P＜ 0.01）。

2.5 血清IL-1β水平對(duì)ADLI患者的預(yù)測(cè)價(jià)值

血清IL-1β水平對(duì)ADLI預(yù)測(cè)價(jià)值以AUC方式評(píng)估，見圖1。血清IL-1β水平 的AUC是0.889（SE為0.037，95%CI：0.817～0.961），進(jìn)一步根據(jù)ROC曲線獲得的各樣本的靈敏度和特異度，計(jì)算約登指數(shù)（Youden'S index=靈敏度+特異度-1），以最大值對(duì)應(yīng)數(shù)據(jù)作為最佳篩查陽性界值（cut-off值），可知，cut-off值為58.55 pg/mL。

表1 ADLI組和非ADLI組一般資料的分布情況Tab.1 Distribution of general data for the ADLI and non-ADLI groups

表2 ADLI組和非ADLI組肝功能指標(biāo)結(jié)果Tab.2 Results of liver function indicators in the ADLI and non-ADLI groups

表3 ADLI組和非ADLI組血清IL-1β與IL-18 表達(dá)水平Tab.3 Serum IL-1β and IL-18 expression levels in the ADLI and non-ADLI groups

3 討論

炎癥反應(yīng)被認(rèn)為是ADLI的關(guān)鍵發(fā)病機(jī)制，細(xì)胞凋亡作為程序性細(xì)胞死亡的主要形式，被證明在藥物誘發(fā)肝損傷的炎癥反應(yīng)中起主要作用［8］。近來，程序性細(xì)胞死亡的另一種重要形式“pyroptosis”被報(bào)道也參與疾病的發(fā)生發(fā)展過程。IL-1β和IL-18是pyroptosis研究中起關(guān)鍵作用的促炎性細(xì)胞因子，可誘發(fā)級(jí)聯(lián)放大的炎癥反應(yīng)，最終誘導(dǎo)細(xì)胞炎性死亡［9］。ADLI是否與IL-1β和IL-18有關(guān)尚未闡明。因此，本研究探討了IL-1β和IL-18與ADLI的關(guān)系。

表4 血清IL-1β 與肝功指標(biāo)相關(guān)性分析Tab.4 Correlation analysis between serum IL-1β and liver function indicators

圖1 血清IL-1β 預(yù)測(cè)ADLI的ROC曲線Fig.1 ROC curve of serum IL-1β predicting ADLI

本研究中，ADLI組與非ADLI組相比，血清IL-1β水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，血清IL-1β與ALT、AST存在相關(guān)性，且IL-1β水平診斷ADIL的AUC為0.889。由此可見，IL-1β會(huì)隨著ADLI 的發(fā)生而升高。IL-1β主要是由激活的單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，但中性粒細(xì)胞、表皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞在受到外界抗原刺激后也可合成與分泌IL-1β，其主要由Toll 樣受體/Nod樣受體通路以及Caspase-1 通路進(jìn)行調(diào)節(jié)和激活，IL-1β是炎癥放大啟動(dòng)因子，可促進(jìn)炎性細(xì)胞的活化與聚集中性粒細(xì)胞［10］。關(guān)于pyroptosis與ADLI的研究雖未見報(bào)道，但已發(fā)現(xiàn)在膿毒癥誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷時(shí)，Caspase-1表達(dá)升高，血清中IL-1β增加，升高的IL-1β加重肝細(xì)胞死亡［11］。苯并［a］芘誘導(dǎo)HL-7702人正常肝細(xì)胞損傷中，也發(fā)現(xiàn)Caspase-1及IL-1β水平升高［12］。IL-1β主要作為促炎性介質(zhì)激活和募集白細(xì)胞，尤其是中性粒細(xì)胞進(jìn)入組織［13］，可參與器官損傷過程［14］。在熱應(yīng)激誘導(dǎo)肝損傷的研究中發(fā)現(xiàn)，抑制 IL-1β可降低肝臟中髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）活性并緩解肝損傷，表明IL-1β在觸發(fā)中性粒細(xì)胞組織浸潤(rùn)和肝損傷中的重要作用。另外，用 IL-1β抑制劑處理的大鼠顯示出較低的血清ALT活性和肝臟組織學(xué)評(píng)分［5］。這些結(jié)果提示，在肝細(xì)胞受到損傷時(shí)伴隨著IL-1β的釋放，其在肝損傷中發(fā)病機(jī)制中起作用。本研究結(jié)果證明在ADLI過程中也伴隨IL-1β的升高，為ADLI中抗IL-1β干預(yù)的研究奠定了基礎(chǔ)。

IL-18也是T細(xì)胞介導(dǎo)肝損傷的媒介，在肝臟中不僅由庫普弗細(xì)胞表達(dá)，也可由損傷的肝細(xì)胞合成［15］。IL-18的分泌可加劇代謝紊亂及免疫功能損傷，此外，IL-18還能促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的增殖和分化，直接介導(dǎo)肝細(xì)胞的損傷［16］。非酒精性脂肪肝病患者與正常人比較，血清IL-18水平升高，提示IL-18可能是脂肪變性損害和肝臟炎癥中的一個(gè)重要發(fā)病因素［17］。然而，本研究中未觀察到升高的IL-18。這可能是因?yàn)镮L-18不是與ADLI關(guān)系密切的指標(biāo)，可能僅在血清中瞬時(shí)釋放，或在受影響的組織或炎癥部位局部表達(dá)。迄今為止，在全基因組及轉(zhuǎn)錄組研究中尚未出現(xiàn)指示體內(nèi)IL-1β釋放的基因表達(dá)特征［18］。

總之，本研究表明血清IL-1β與ADLI有關(guān)聯(lián)，在ADLI診斷中具有潛在價(jià)值。下一步需研究IL-1β促成ADLI的發(fā)病機(jī)制，探索IL-1β在ADLI中靶向治療的可能性。