朱連成，郭騫，勾睿，劉娟娟，劉晴，林蓓

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科，沈陽(yáng) 110004）

卵巢癌作為女性生殖系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤，其死亡率居女性惡性腫瘤之首，大部分患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已經(jīng)是晚期［1］，其原因包括早期轉(zhuǎn)移、早期診斷困難及化療耐藥等［2］。人附睪蛋白4（human epididymis protein 4，HE4），又名乳清酸性蛋白4-二硫鍵核心結(jié)構(gòu)域2（WAP four-disulfide core domain protein 2，WFDC2），是通過(guò)基因組及蛋白質(zhì)組學(xué)篩選獲得的卵巢癌腫瘤標(biāo)志物，2008年被美國(guó)FDA指定為監(jiān)測(cè)上皮性卵巢癌復(fù)發(fā)的血清標(biāo)志物，其敏感性、特異性較高，近年來(lái)引起研究者廣泛關(guān)注［3-5］，然而大部分研究集中于早期診斷、判斷預(yù)后等臨床方面，關(guān)于其對(duì)卵巢癌惡性生物學(xué)行為影響的機(jī)制研究較少［6-9］。因此，本研究采用了基因芯片技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)染了HE4基因的卵巢癌細(xì)胞系及其對(duì)應(yīng)的空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞進(jìn)行基因表達(dá)序列分析，找到差異表達(dá)基因并對(duì)其進(jìn)行基因和蛋白水平的驗(yàn)證，本研究采用基因本體（gene ontology，GO）及京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，初步探討與HE4相關(guān)的分子機(jī)制，以期為卵巢癌中HE4相關(guān)的機(jī)制研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)、質(zhì)粒構(gòu)建及HE4基因轉(zhuǎn)染

人類上皮性卵巢癌細(xì)胞系ES-2購(gòu)自美國(guó)ATCC，培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%盤尼西林/鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，37℃恒溫，5% CO2加濕。全長(zhǎng)人類HE4cDNA擴(kuò)增 pEGFP-N1或者pCMV6質(zhì)粒，引物如下：P1，5'-TCCGCTCGAGATGCCTGCTTGTCGCCT AG-3'；P2，5'-ATGGGGTACCGTGAAATTGGGAGTG ACACAGG-3'。轉(zhuǎn)染采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒。細(xì)胞系分別標(biāo)記為HE4高表達(dá)（HE4-H，O）和其對(duì)照空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞（HE4-H-Mock，OV），見(jiàn)表1。

1.2 實(shí)時(shí)PCR驗(yàn)證

TRIzol法分別提取各組細(xì)胞總RNA，SuperScriptⅢ反轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用Roche LightCycler480進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)。HE4引物及內(nèi)參GAPDH引物見(jiàn)表2。按照試劑說(shuō)明和儀器操作規(guī)程將樣品總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，于Roche LightCycler 480進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)，利用儀器所匹配的軟件計(jì)算每個(gè)基因的Ct值，常規(guī)采用ΔΔCt方法比較各自基因的表達(dá)量變化，并與基因芯片結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。反應(yīng)至少進(jìn)行3次。

表1 細(xì)胞系樣本及RNA質(zhì)量評(píng)定Tab.1 Cell line samples and RNA quality evaluation

1.3 總RNA提取及質(zhì)控

每組細(xì)胞系采用2個(gè)樣品進(jìn)行準(zhǔn)備，使用RNeasy Mini kit試劑盒提取總RNA，并以RNeasy MinElute Cleanup columns進(jìn)一步純化。使用NanoDrop DN-1000對(duì)RNA質(zhì)量及純度進(jìn)行評(píng)估，A260/A280≥1.8且A260/A230≥1.5作為標(biāo)準(zhǔn)?？俁NA質(zhì)量采用變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。2組標(biāo)本的RNA標(biāo)記及檢測(cè)數(shù)值見(jiàn)表1。

1.4 基因芯片雜交、數(shù)據(jù)收集

本研究中，每組標(biāo)本采用3張芯片進(jìn)行分析以充分降低誤差。樣品使用Phalanx雜交系統(tǒng)試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增和標(biāo)記，采用 Human Whole Genome OneArray?（HOA6.1）芯片進(jìn)行雜交。該芯片有30 275個(gè)DNA寡核苷酸探針，其中29 187個(gè)在RefSeq v38和Ensembl v56數(shù)據(jù)庫(kù)中索引，含有1 088個(gè)質(zhì)控探針。反應(yīng)過(guò)程如下：50 ℃雜交16 h，3步法洗脫非特異性結(jié)合（步驟1，42 ℃洗脫 5 min 1次；步驟2，42 ℃洗脫5 min 1次，25 ℃洗脫5 min；步驟3，沖洗20次），芯片離心后烘干并使用Axon4000B對(duì)芯片的信號(hào)強(qiáng)度數(shù)據(jù)進(jìn)行掃描提取。

1.5 實(shí)時(shí)PCR驗(yàn)證芯片結(jié)果

為了后續(xù)研究的持續(xù)性，在差異表達(dá)基因中挑選了上調(diào)的2個(gè)基因（FOXA2和SERPIND1），在2組細(xì)胞系中進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR分析，從而在RNA水平驗(yàn)證芯片結(jié)果。以GAPDH作為內(nèi)參，引物由Invitrogen公司合成，方法同上。引物序列及產(chǎn)物見(jiàn)表2。

1.6 免疫組化驗(yàn)證芯片結(jié)果

選取經(jīng)過(guò)實(shí)時(shí)PCR驗(yàn)證過(guò)的基因SERPIND1，同HE4一起，進(jìn)行免疫組化驗(yàn)證其在卵巢癌組織中的表達(dá)。標(biāo)本來(lái)源于2004年到2012年由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院婦科收集的50例卵巢癌組織。按照常規(guī)SP方法對(duì)所有石蠟切片進(jìn)行HE4及SERPIND1免疫組化染色，二者的一抗?jié)舛葹榉謩e為1 ∶100和1 ∶400，肝癌組織作為陽(yáng)性對(duì)照，結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)為定位于胞質(zhì)或胞膜中的棕黃色顆粒為陽(yáng)性染色。在400倍光學(xué)顯微鏡下選擇具有代表性的5個(gè)高倍鏡視野，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：染色程度0 分，基本不著色；1分，淡黃色；2分，棕黃色；3分，棕褐色。著色細(xì)胞占計(jì)數(shù)細(xì)胞的百分率：0分，0%～5%；1分，＞5%～25%；2分，＞25%～50%；3分，＞50%～75%；4分，＞75%～100%。最后得分為兩者的乘積：0～2分標(biāo)記為-，3～4分標(biāo)記為+，5～8分標(biāo)記為++，9～12分標(biāo)記為+++。-及+判定為低表達(dá)，++及+++判定為高表達(dá)。2位獨(dú)立閱片者分別對(duì)標(biāo)本進(jìn)行評(píng)判。

表2 實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)中各基因所用引物序列及產(chǎn)物大小Tab.2 Gene-specific primers used in real time-PCR and their products

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GenePix4.1軟件對(duì)基因芯片采集的所有數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，篩選差異表達(dá)基因的條件是log2∣倍數(shù)變化∣≥1.5同時(shí)P＜ 0.05。對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO及KEGG信號(hào)通路等富集分析。應(yīng)用 SPSS 20.0進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman方法，應(yīng)用GraphPad Prism進(jìn)行制圖。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染細(xì)胞驗(yàn)證及總RNA質(zhì)量檢驗(yàn)結(jié)果

分別對(duì)3組細(xì)胞進(jìn)行HE4的mRNA表達(dá)含量測(cè)定，發(fā)現(xiàn)HE4在HE4轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞（2.403±0.473 vs 1.128±0.102，P＜ 0.001）及原始未處理組細(xì)胞（2.403±0.473 vs 1.112±0.099，P＜ 0.001），而后2組細(xì)胞的HE4表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.909）。將HE4轉(zhuǎn)染組及空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組標(biāo)本的RNA進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)2組的A260/A280比率為2.02，A260/A230比值為2.21～2.35（表1），瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)可見(jiàn)RNA條帶清晰，無(wú)向低分子量區(qū)域的成片拖帶現(xiàn)象，說(shuō)明2組樣品總RNA完整，無(wú)降解（圖1），樣品RNA的質(zhì)量滿足基因芯片雜交檢驗(yàn)的質(zhì)控要求。

2.2 芯片雜交結(jié)果

圖1 轉(zhuǎn)染細(xì)胞的總RNA凝膠電泳Fig.1 Gel electrophoresis for total RNA of ovarian cancer cells

對(duì)所有采集的信號(hào)統(tǒng)一歸一化log10計(jì)算，而后進(jìn)行散點(diǎn)圖分析以評(píng)估實(shí)驗(yàn)芯片的變異性，同時(shí)進(jìn)行火山圖分析以顯示差異表達(dá)基因。結(jié)果顯示，樣品總體的數(shù)據(jù)變異性較?。▓D2A），倍數(shù)變化存在顯著的差異性，可挑選出差異表達(dá)基因（圖2B），其中356個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，283個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，數(shù)據(jù)可靠。按照倍數(shù)變化由高到低排序，列出2組10個(gè)代表性差異表達(dá)基因，見(jiàn)表3。

2.3 GO富集分析

GO 富集分析結(jié)果顯示，差異表達(dá)的基因在分子功能上，參與到了酶、轉(zhuǎn)錄因子及DNA結(jié)合；在細(xì)胞成分上，參與到了細(xì)胞核、胞質(zhì)及胞外域作用；在生物過(guò)程上，參與到了生物高聚物代謝、程序性細(xì)胞死亡及凋亡等。見(jiàn)表4。

2.4 信號(hào)通路分析

對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG通路分析，發(fā)現(xiàn)MAPK、性激素生物合成、癌癥、細(xì)胞周期、p53信號(hào)等通路顯著富集，見(jiàn)表5。

圖2 數(shù)據(jù)歸一化處理后的散點(diǎn)圖及火山圖Fig.2 Scatter plot and volcano plot after normalization

2.5 實(shí)時(shí)PCR及免疫組織化學(xué)方法驗(yàn)證芯片結(jié)果

在差異表達(dá)基因中挑選2個(gè)表達(dá)上調(diào)的基因（FOXA2、SERPIND1）進(jìn)行了實(shí)時(shí)PCR實(shí)驗(yàn)以驗(yàn)證芯片結(jié)果的可靠性，結(jié)果顯示，基因FOXA2的mRNA相對(duì)表達(dá)在HE4轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中為4.712±1.504，明顯高于空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組（1.177±0.264，P=0.002）及原始未處理組（1.238±0.394，P=0.002）的表達(dá)量，而后兩組的表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.757）；基因SERPIND1的mRNA相對(duì)表達(dá)在HE4轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中為1.703±0.487，明顯高于空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組（0.956±0.246，P=0.006）及原始未處理組（0.959±0.080，P=0.006）的表達(dá)量，而后兩組的表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.977）。實(shí)時(shí)PCR的結(jié)果與基因芯片顯示的結(jié)果相一致。將經(jīng)過(guò)實(shí)時(shí)PCR驗(yàn)證的SERPIND1通過(guò)免疫組化方法進(jìn)行蛋白水平的驗(yàn)證。結(jié)果顯示，類似于HE4，SERPIND1在細(xì)胞中的表達(dá)以胞質(zhì)及胞膜中為主（圖3），HE4及SERPIND1在卵巢癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為78%及88%，高表達(dá)率分別為66%及62%。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在50例標(biāo)本中，HE4及SERPIND1同時(shí)陰性的有4例，同時(shí)陽(yáng)性的有37例，Spearman相關(guān)性分析提示兩者表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.402，P=0.003）。以上通過(guò)基因及蛋白水平，驗(yàn)證了基因芯片結(jié)果的可靠性。見(jiàn)表6。

表3 差異表達(dá)基因列表（上調(diào)及下調(diào)基因各列出10個(gè)代表性基因）Tab.3 Gene list of differentially expressed genes（selective 10 up and down genes）

表4 各組差異表達(dá)基因GO富集分析Tab.4 GO enrichment analysis with differentially expressed genes

表5 差異表達(dá)基因參與的信號(hào)通路Tab.5 Results of the KEGG pathway analysis for differentially expressed genes

圖3 免疫組化檢查驗(yàn)證基因芯片結(jié)果Fig.3 Immunohistochemical staining for validation of differentially expressed genes

表6 HE4及SERPIND1在卵巢癌組織中表達(dá)的相關(guān)性分析Tab.6 The relevance analysis of HE4 and SERPIND1 expression in ovarian cancer

3 討論

卵巢癌的發(fā)病率居于婦科惡性腫瘤第三位，每年可導(dǎo)致全球范圍內(nèi)15萬(wàn)患者死亡［1］。因此，找到能夠早期診斷、監(jiān)測(cè)預(yù)后的指標(biāo)，對(duì)于提高卵巢癌患者的生存率有著重要作用。HE4在卵巢癌的早期診斷、預(yù)后評(píng)估等諸多方面引起大家的廣泛關(guān)注［10-11］，但關(guān)于它的基礎(chǔ)研究甚少。本研究通過(guò)基因芯片分析了轉(zhuǎn)染HE4基因后卵巢癌細(xì)胞基因表達(dá)的變化，這些差異基因的已知功能，可為卵巢癌中HE4的研究提供新思路。

SERPIND1基因也被稱為肝素輔因子Ⅱ（heparin co-factorⅡ），屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑（Serpin）超家族成員［12］，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)許多Serpin家族的成員與腫瘤的發(fā)展有關(guān)，比如SERPINI2、SERPINB5、SERPINA9分別參與到了乳腺癌、前列腺癌和B細(xì)胞淋巴瘤等腫瘤的轉(zhuǎn)移發(fā)展中［13-14］。SERPIND1的相互作用蛋白FGA、FGB、FGG與肺癌的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程可能存在相關(guān)性，而其上游調(diào)控因子也可能參與卵巢癌的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化［15］。在非小細(xì)胞肺癌中，SERPIND1可以通過(guò)PI3K途徑促進(jìn)肺癌細(xì)胞生成偽足，增強(qiáng)侵襲和遷移能力，它的過(guò)表達(dá)與更易復(fù)發(fā)及更短的生存時(shí)間相關(guān)［16］。本研究發(fā)現(xiàn)SERPIND1的基因及蛋白表達(dá)水平在卵巢癌中增高，且和HE4表達(dá)呈正相關(guān)，對(duì)該基因的進(jìn)一步研究，有望為卵巢癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制、診斷標(biāo)記物的研發(fā)等提供理論依據(jù)。

HE4可以促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移、耐藥［6，17-18］，但相關(guān)的作用機(jī)制仍存在爭(zhēng)議。有研究［9］發(fā)現(xiàn)HE4可通過(guò)激活EGFR-MAPK信號(hào)通路促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的黏附、遷徙和腫瘤生長(zhǎng)，而其他研究者發(fā)現(xiàn)HE4通過(guò)抑制細(xì)胞增殖而在卵巢癌進(jìn)展中起到保護(hù)性作用，推測(cè)該行為可能是通過(guò)激活MAPK和PI3K/Akt途徑產(chǎn)生［19］；HE4可與膜聯(lián)蛋白A2形成復(fù)合體，通過(guò)MAPK和FOCAL信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤惡性進(jìn)展［5，7］；HE4可以與EGFR，IGF1R和轉(zhuǎn)錄因子HIF1α相互作用，促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的侵襲、耐藥［17］；HE4可激活A(yù)KT和Erk途徑誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞的耐藥［4］。本研究找到了和HE4表達(dá)相關(guān)的通路，包括MAPK、性激素生物合成、細(xì)胞周期、p53等，首次在基因水平上為HE4相關(guān)的基礎(chǔ)研究提供了切實(shí)可靠的參考。

綜上，本研究通過(guò)基因芯片分析了轉(zhuǎn)染HE4基因后卵巢癌細(xì)胞基因表達(dá)的變化，鑒別出了差異表達(dá)基因，其中，上調(diào)283個(gè)，下調(diào)356，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行基因及蛋白水平的驗(yàn)證，GO富集分析發(fā)現(xiàn)差異基因在生物過(guò)程中，參與到了生物高聚物代謝、程序性細(xì)胞死亡及凋亡等，KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)差異基因參與到了MAPK、性激素生物合成、癌癥、細(xì)胞周期、p53信號(hào)等。這些結(jié)果為卵巢癌中HE4的功能、機(jī)制和相互作用等基礎(chǔ)研究提供了新的理念及參考。