周 潯，陳 順，宗傳峰，高守紅 （.海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院藥學(xué)部，上海 004；.海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院藥學(xué)部，上海 0000；.解放軍 7 部隊(duì)，浙江 金華 000）

丙戊酸鈉（valproate acid，VPA）是臨床上常用的廣譜抗癲癇藥，對各種類型癲癇均有治療作用，且廣泛用于其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病[1-2]。研究顯示，長期使用VPA存在潛在的不良反應(yīng)，臨床上常見的不良反應(yīng)主要有胰腺炎、致畸性和肝毒性，其中最嚴(yán)重的不良反應(yīng)就是肝毒性，嚴(yán)重時(shí)甚至可發(fā)生急性肝壞死[3-4]。因此，深入研究VPA肝毒性的發(fā)病機(jī)制，對于預(yù)防VPA毒副作用和促進(jìn)臨床安全用藥具有重要指導(dǎo)意義。

VPA在體內(nèi)的代謝受多種因素影響，治療窗范圍窄，個(gè)體差異大，有效治療血藥濃度為50～100 μg/ml，超過 100 μg/ml易產(chǎn)生不良反應(yīng)，因此需要進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測[5-6]。VPA的毒副作用與其血藥濃度相關(guān)，及時(shí)監(jiān)測血藥濃度可有效控制癲癇發(fā)作和減少不良反應(yīng)發(fā)生。研究顯示，VPA的肝毒性與其體內(nèi)代謝特征相關(guān)，VPA及其代謝產(chǎn)物所誘導(dǎo)的線粒體功能障礙與肝毒性相關(guān)[7-9]。已有研究證明，VPA的不飽和代謝產(chǎn)物2-丙基-4-五烯酸（2-propyl-4-pentenoic acid，4-ene-VPA）能通過抑制線粒體脂肪酸的β氧化，還能通過各種代謝途徑與谷胱甘肽反應(yīng)使其大量消耗降低機(jī)體的抗氧化能力進(jìn)而產(chǎn)生肝毒性。但是，少見有3-羥基丙戊酸（3-hydroxy valproic acid，3-OH-VPA）和 5-羥基丙戊酸（5-hydroxy valproic acid，5-OH-VPA）與肝毒性相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道。本課題組前期對VPA及其代謝產(chǎn)物的體外肝毒性研究中發(fā)現(xiàn)，VPA及3個(gè)代謝產(chǎn)物對體外人正常肝細(xì)胞增殖具有一定抑制作用，且表現(xiàn)為時(shí)間依賴性和濃度依賴性[9]。本研究首次將VPA及其3個(gè)代謝產(chǎn)物血藥濃度對肝毒性的診斷進(jìn)行分析和比較，將VPA的3個(gè)代謝產(chǎn)物作為生物標(biāo)志物用于臨床肝損毒性診斷，為臨床安全給藥提供合理依據(jù)。

1 樣本與材料

1.1 樣本來源

自2016年4月至2018年3月，收集海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院臨床藥理實(shí)驗(yàn)室服用VPA治療的癲癇患者血樣，共收集肝功能正常癲癇患者血樣205例，肝功能異常癲癇患者血樣123例。入選標(biāo)準(zhǔn)：僅為癲癇患者無其他并發(fā)癥，單用VPA治療癲癇，取血時(shí)間點(diǎn)達(dá)穩(wěn)態(tài)血藥濃度，無聯(lián)合用藥，服藥前后均做過肝功能檢查者。排除標(biāo)準(zhǔn)：有其他并發(fā)癥、服藥前肝或腎功能異常、與其他藥物聯(lián)合使用患者。

1.2 儀器與試劑

安捷倫1200高效液相色譜串聯(lián)安捷倫6410 A質(zhì)譜儀（美國安捷倫公司），丙戊酸鈉（VPA，批號(hào)：FLA3C，純度：98%，東京化工有限公司），2-丙基-4-五烯酸（4-ene-VPA，批號(hào)：3-XAL-91-4，純度98%）、3-羥基丙戊酸（3-OH-VPA，批號(hào)：1-TVP-92-13）、3-羥基丙戊酸（5-OH-VPA，批號(hào)：1-TVP-149-5）均購自多倫多研究化學(xué)品公司，苯甲酸（批號(hào)：TS0911CA14，純度98%，上海源葉生物科技有限公司），甲醇、甲酸、醋酸銨均為進(jìn)口色譜級(jí)試劑（德國Merck公司）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量數(shù)據(jù)用(±s)表示，采用單因素方差和t檢驗(yàn)分析，以P＜ 0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 方法

2.1 標(biāo)本采集

收集123例肝功能異常（谷丙轉(zhuǎn)氨酶ALT＞50）癲癇患者血樣為實(shí)驗(yàn)組，男性96例，女性27例；205例肝功能正常癲癇患者血樣為對照組，男性127例，女性78例?？诜焖徕c緩釋片（德巴金），首次服藥2周，調(diào)整劑量后1周，在患者血藥濃度達(dá)穩(wěn)態(tài)后，取清晨空腹靜脈血 2～3 ml，經(jīng) 3 000 r/min離心10 min，取血清監(jiān)測血藥濃度。

2.2 血藥濃度的測定

采用本課題組前期建立的LC-MS/MS測定VPA和其 3個(gè)代謝產(chǎn)物 3-OH-VPA、4-ene-VPA和5-OH-VPA的方法[10]。檢測兩組癲癇患者血樣中的VPA及其代謝產(chǎn)物血藥濃度。其中，VPA及其3個(gè)代謝產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍分別為VPA：2～150 μg/ml；4-ene-VPA: 50～5 000 ng/ml；3-OH-VPA 及 5-OH-VPA：50～1 000 ng/ml。

3 結(jié)果

3.1 肝功能正常與異常的癲癇患者血藥濃度比較

將肝功能正常組與肝功能異常組患者的VPA及其3個(gè)代謝產(chǎn)物血藥濃度分析比較，結(jié)果顯示，肝功能異常組平均血藥濃度比肝功能正常組高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示肝毒性不僅與VPA血藥濃度有關(guān)，且與代謝產(chǎn)物血藥濃度也有關(guān)系，結(jié)果見表1。

3.2 丙戊酸鈉及其代謝產(chǎn)物對肝毒性相關(guān)性分析

從本研究收集的123例肝功能異常者不同血藥濃度分布（表2）可以看出，未超過中毒血藥濃度而產(chǎn)生肝毒性的患者占69.10%，超過中毒血藥濃度而產(chǎn)生肝毒性的患者占30.90%。結(jié)果表明：僅檢測VPA血藥濃度可能不能及時(shí)發(fā)現(xiàn)肝毒性不良反應(yīng)的發(fā)生，因此考慮代謝產(chǎn)物的血藥濃度是否可作為診斷肝損傷的參考指標(biāo)。以VPA及其3個(gè)代謝產(chǎn)物血藥濃度為變量做受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC），檢測其診斷肝毒性損傷的能力，因ROC曲線不受患者患病率的影響，對臨床診斷具有研究意義。對VPA及其3個(gè)代謝產(chǎn)物進(jìn)行ROC曲線作圖，可看出ROC曲線下面積分別為0.690、0.682、0.594和0.736，均大于 0.5，P值均小于 0.05，說明 VPA及其3個(gè)代謝產(chǎn)物可以用于肝毒性的診斷。因此，通過同時(shí)監(jiān)測VPA及3個(gè)代謝產(chǎn)物的血藥濃度能更好地預(yù)警肝毒性不良反應(yīng)的發(fā)生，及時(shí)調(diào)整癲癇患者VPA的劑量，為臨床合理化用藥提供幫助。結(jié)果見表2、表3、圖1。

表 1 兩組患者 VPA 及其 3 個(gè)代謝產(chǎn)物平均血藥濃度比較 (±s)

表 1 兩組患者 VPA 及其 3 個(gè)代謝產(chǎn)物平均血藥濃度比較 (±s)

*P＜0.05，**P＜0.01，與肝功能正常組比較。

組別 VPA（μg/ml） 4-ene-VPA（ng/ml） 3-OH-VPA（ng/ml） 5-OH-VPA（ng/ml）肝功能正常組（n=205） 62.44±31.24 3 229.34±1 704.30 597.85±396.13 446.01±403.15肝功能異常組（n=123） 83.50±31.57** 4 306.01±1 811.00** 740.43±609.33* 795.14±557.11**

表 2 123 例肝功能異?；颊哐帩舛确植?/p>

表 3 VPA 及其 3 個(gè)代謝產(chǎn)物 ROC 曲線分析參數(shù)

圖 1 VPA 及其 3 個(gè)代謝產(chǎn)物的 ROC 曲線

4 討論

VPA在體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)復(fù)雜，治療窗窄，個(gè)體差異大，其毒副作用與其血藥濃度相關(guān)，本研究對肝功能正常與異常的癲癇患者的VPA及其3個(gè)代謝產(chǎn)物血藥濃度與肝毒性進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示：肝功能異常組中VPA及其3個(gè)代謝產(chǎn)物的血藥濃度均高于肝功能正常組患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示 VPA代謝產(chǎn)物中不僅 4-ene-VPA血藥濃度與肝毒性有關(guān)，3-OH-VPA和5-OHVPA與肝毒性也有關(guān)系，同時(shí)監(jiān)測VPA及其3個(gè)代謝產(chǎn)物血藥濃度可以更好地預(yù)警肝毒性不良反應(yīng)的發(fā)生。

本研究通過VPA及其3個(gè)代謝產(chǎn)物血藥濃度為變量做ROC曲線，檢測其診斷肝毒性損傷的能力，通過ROC曲線分析，VPA及其3個(gè)代謝產(chǎn)物的血藥濃度均可作為診斷肝損傷的參考指標(biāo)。其中，5-OH-VPA的ROC曲線下面積大于VPA。

綜上，VPA及其3個(gè)代謝產(chǎn)物血藥濃度均與肝毒性有關(guān)，這與課題組之前研究的VPA及其3個(gè)代謝產(chǎn)物對人體正常肝細(xì)胞體外肝毒性實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果一致，3-OH-VPA組和5-OH-VPA組差異更為明顯。本研究還以VPA及其3個(gè)代謝產(chǎn)物血藥濃度為變量做ROC曲線，檢測其診斷肝毒性損傷的能力，5-OH-VPA大于VPA的ROC曲線下面積，結(jié)果提示臨床可結(jié)合VPA及其代謝產(chǎn)物的血藥濃度設(shè)計(jì)臨床個(gè)體化給藥方案，還可作為預(yù)警肝毒性不良反應(yīng)發(fā)生的指標(biāo)，為臨床安全、有效給藥提供參考。對于將VPA3個(gè)代謝產(chǎn)物作為標(biāo)志物用于臨床肝毒性診斷，還有待加大樣本量驗(yàn)證，以確保診斷的特異性。