孟 飛，宋學(xué)立 （中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九六〇醫(yī)院淄博院區(qū)，山東 淄博 255300）

白蘞為葡萄科蛇葡萄屬植物白蘞的干燥塊根，首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》。白蘞是最早用于瘡癰、燙傷[1]治療的藥物，具有解毒、生肌的功效。資料顯示，白蘞在皮膚創(chuàng)傷治療中的使用頻率較高。隨著白蘞藥理研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)白蘞還具有抗菌、抗病毒[2-6]、免疫調(diào)節(jié)及促進潰瘍快速愈合等作用。

在2015版《中國藥典》中，白蘞的質(zhì)量標準只有定性分析而無定量分析。白蘞成分檢測中發(fā)現(xiàn)其含大黃素等蒽醌類活性成分[7]，且白蘞中大黃素的定量測定方法文獻資料[8-9]較少。本實驗采用反相高效液相色譜法，建立白蘞藥材中大黃素含量測定方法，為白蘞的質(zhì)量控制標準提供方法和依據(jù)。

1 試藥與儀器

1.1 試藥

大黃素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110756-201512，經(jīng)面積歸一化法計算含量為99.1%）；甲醇（煙臺遠東精細有限公司，批號：160706）為色譜純，水為超純水，磷酸（萊陽市雙雙化工有限公司，批號：2010246）為分析純，硫酸（淄博市淄川區(qū)張莊化學(xué)試劑廠，批號：950626）為分析純。白蘞飲片（安國市弘發(fā)中藥材飲片有限公司，批號：131001），經(jīng)淄博市中醫(yī)院藥品供應(yīng)科主任魏星教授鑒定為葡萄科蛇葡萄屬植物白蘞Ampelopsis japonica(Thunb.) Makino 的干燥塊根。

1.2 儀器

Lab Alliance PC 3000 高效液相色譜儀（美國科學(xué)系統(tǒng)公司），紫外檢測器（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；LD310-2R電子天平（沈陽龍騰電子有限公司）；FA/JA系列電子天平（上海上平儀器有限公司）；RE-201D型恒溫水浴鍋、RE-201D型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（鄭州博科儀器設(shè)備有限公司）；766-3型遠紅外快速干燥箱（江蘇省南通縣金余電器配件廠）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Apollo-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為甲醇-0.2%磷酸溶液（85:15），流速1.0 ml/min，檢測波長 220 nm，進樣量 20 μl。在此條件下，大黃素與相鄰色譜峰分離度良好，無干擾，理論塔板數(shù)為2 000。對照品與供試品色譜圖見圖1。

2.2 溶液的配制

2.2.1 對照品溶液的制備

取大黃素對照品（含量為99.1%）約10 mg，精密稱定，置于 1 000 ml 容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得濃度為 9.91 μg /ml 的大黃素對照品儲備液，備用。

2.2.2 供試品溶液的制備

取過5目篩的白蘞藥材粉末，置烘箱內(nèi)（70±2）℃，2 h 烘干。精密稱量 30 g，用 10 倍量質(zhì)量分數(shù) 20%的硫酸在 50 ℃條件下回流水解2 h。過濾，取濾渣。濾渣用純化水洗至中性（pH=7），烘干。稱其質(zhì)量，記錄。再以8倍量體積的95%乙醇在82 ℃條件下回流提取2次，每次1 h，過濾，合并乙醇提取液，減壓蒸餾，濃縮至無醇味，加乙醇溶解并定容于10 ml容量瓶中，即得供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察

分別精密量取“2.2.1”項下制備的大黃素對照品溶液各 125、250、500、1 000、2 000、4 000 μl，分別置10 ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，配制成6種不同濃度的對照品溶液。依次精密吸取對照品溶液各20 μl注入高效液相色譜儀中，記錄峰面積。以峰面積Y為縱坐標，對照品溶液濃度Χ為橫坐標，進行線性回歸，得回歸方程為Y= 53 962Χ-966.46，r= 0.999 7；結(jié)果表明大黃素在 0.124～3.968 μg/ml濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.2 精密度試驗

精密量取對照品溶液 20 μl，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，測定峰面積。大黃素峰面積RSD為1.7%。儀器精密度良好，符合要求。

2.3.3 重復(fù)性試驗

精密稱取同一批號樣品6份，按“2.2.2”項下方法平行制備樣品溶液，在“2.1”項色譜條件下，分別進樣，測定大黃素的峰面積，RSD為 1.2%（n= 6），結(jié)果表明本方法重復(fù)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗

按“2.1”項下色譜條件，分別精密量取在室溫（10～30 ℃）下放置 0、2.5、5、7.5、10、24 h的同一份供試品溶液各20 μl進樣測定，記錄大黃素的峰面積，6次進樣結(jié)果表明，供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定，RSD為1.5%。

2.3.5 加樣回收率試驗

取同一批次（批號：20170704）已知含量的白蘞藥材樣品9份，分別按相當(dāng)于樣品溶液中大黃素含量的 80%（n=3）、100%（n=3）、120%（n=3）加入“2.3.1”項下制備的對照品溶液，按“2.2”項下色譜條件進行測定。計算回收率，結(jié)果見表1。

2.3.6 樣品測定

取不同批次白蘞藥材樣品，分別按“2.3.2”項下方法制備樣品溶液，按“2.2”項下色譜條件測定峰面積，連續(xù)進樣3次，以外標法計算含量，測定結(jié)果見表2。

圖 1 白蘞 HPLC 圖

表 1 白蘞藥材樣品加樣回收率試驗結(jié)果

表 2 白蘞樣品大黃素含量測定結(jié)果 (n=3)

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

3.1.1 檢測波長的選擇

筆者所查文獻[8-10]中，測量大黃素所用波長有254、290 nm等。通過實驗發(fā)現(xiàn)，不同的波長影響其重現(xiàn)性及靈敏度。通過對大黃素標準品甲醇溶液全波段（200～400 nm）紫外掃描可見:其在 220、254、260、272、278 nm 處均具有特征吸收。通過綜合比較上述波長處大黃素峰的峰形及峰面積，220 nm處波長的峰形較好、干擾少、峰面積較大，故選定220 nm作為白蘞藥材中大黃素的測定波長。

3.1.2 流動相的選擇

大黃素的化學(xué)名為1'3'8-三羥基-6-甲基蒽醌，具有一定的極性和酸性。所查文獻中，大黃素含量測定的流動相體系有多種。在實驗過程中發(fā)現(xiàn)，流動相對色譜峰的保留時間及分離度有較大影響。故本實驗在選擇流動相時，考察了不同比例的甲醇-水，乙腈-水，甲醇 :0.1% 磷 酸溶液[8-10]，甲醇:0.5%磷酸溶液[11]，甲醇:0.2%磷酸溶液，甲醇:0.02%磷酸溶液，甲醇:1% 冰醋酸[12]等不同溶劑系統(tǒng)，結(jié)果表明，相同條件下，甲醇:0.2%磷酸溶液（85:15）為流動相時，可以達到基線分離，出峰時間較短，峰形較好。

3.1.3 流速與進樣量的選擇

在流動相及波長選定的條件下，考察了不同流速（0.5～2.0 ml/min）對出峰時間的影響，當(dāng)流速小于1.0 ml/min時，保留時間延長，使流動相的用量增加，會造成試劑的浪費；當(dāng)流速大于1.0 ml/min時，保留時間縮短，但大黃素的峰會與雜質(zhì)峰產(chǎn)生重疊，影響分離度及重現(xiàn)性。本實驗選擇1.0 ml/min作為流速。

在樣品濃度一定的條件下，考察了不同進樣體積（10～30 μl）的影響。實驗結(jié)果表明，進樣體積小于 20 μl時，重現(xiàn)性及靈敏度均下降；大于 20 μl時，雜質(zhì)峰明顯。當(dāng)進樣量為20 μl時，峰的對稱性得到保證。因此，本實驗選擇20 μl為進樣量。

3.2 樣品提取方法的選擇

已有文獻[8]對白蘞中大黃素的提取方法采用甲醇提取及三氯甲烷萃取法。通過實驗發(fā)現(xiàn)這種方法穩(wěn)定性差、步驟煩瑣，且所用試劑毒性較大。本實驗在上述提取方法的基礎(chǔ)上，參照大黃藥材中大黃素的提取方法[10]，通過4因素（粒度、溶劑劑量、溶劑濃度、提取時間）3水平的正交設(shè)計確定了白蘞中大黃素的提取方法。結(jié)果表明，采用過5目篩的白蘞粉末，先用20%的硫酸在50 ℃條件下回流酸水解2 h，濾渣用純化水洗至中性。再用8倍量體積的95%乙醇，水浴回流2 h能夠達到較好的提取效果。白蘞中含大黃素等游離蒽醌，還含有結(jié)合型蒽醌[13-14]。先進行酸水解，使結(jié)合型蒽醌水解，結(jié)果大黃素的含量有所提高。白蘞具有的抗菌性與其中的大黃素[15-16]有關(guān)，大黃素是白蘞的活性成分。本提取方法克服了以往相關(guān)文獻報道方法的不足，分離度好、重現(xiàn)性好、結(jié)果準確，因此大黃素作為白蘞藥材中指標成分有一定可行性，為完善白蘞藥材的質(zhì)量控制標準提供了方法和依據(jù)。新藥臨床試驗的質(zhì)量是藥品上市后安全、有效的保障[17]，所以臨床試驗過程中的質(zhì)量控制尤為重要。包括相似性評價（外觀檢測和觀感評估測試）、安全性評價（常規(guī)安全性檢測）、適用性評價（薄層鑒別、HPLC、指標成分測定和藥理實驗）和最終制劑的質(zhì)量標準。臨床試驗過程中的質(zhì)量控制所要評價的范圍更廣、要求更為嚴格，是為了確保臨床數(shù)據(jù)的真實、準確、完整和可靠，為下一步臨床應(yīng)用提供依據(jù)，對提高醫(yī)療水平具有重大意義。