崔曉林，陸 峰 （海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥物分析教研室，上海 200433）

0 引言

表面增強(qiáng)拉曼光譜 (surface-enhanced Raman spectroscopy, SERS)是在拉曼光譜技術(shù)上發(fā)展起來的，一種快速、靈敏、簡便、無損的分析方法[1-2]，可用于食品、藥物、環(huán)境污染、生物分子、細(xì)菌等物質(zhì)的結(jié)構(gòu)鑒定、定性定量分析等[3-7]。其主要有兩種增強(qiáng)機(jī)制：化學(xué)增強(qiáng)和電磁增強(qiáng)[8-9]。兩種機(jī)制共同作用，可使SERS信號(hào)增強(qiáng)106～1014倍。SERS圖譜包含待測物質(zhì)詳細(xì)的指紋圖譜信息，即使是細(xì)微的結(jié)構(gòu)差別，在SERS圖譜上均有明顯不同，是區(qū)分結(jié)構(gòu)類似物很好的技術(shù)手段[10]。同時(shí)，因其簡便、快速等特性使得SERS技術(shù)可以應(yīng)用于原位現(xiàn)場檢測。

黃嘌呤、茶堿、可可堿均屬于嘌呤類衍生物，在結(jié)構(gòu)上十分相似，其中，茶堿和可可堿與黃嘌呤是同系物，茶堿與可可堿是同分異構(gòu)體。臨床上常用黃嘌呤或茶堿進(jìn)行支氣管擴(kuò)張、哮喘治療等，可可堿常用來降低血液黏度[11-13]。較窄的治療窗使得臨床應(yīng)用此類藥物時(shí)通常需要對(duì)其進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測，以防止用藥過量或不足等情況發(fā)生。但是，由于這3種物質(zhì)的結(jié)構(gòu)類似物很多，且常見于普通食品之中。如發(fā)生誤服，易導(dǎo)致檢測到的數(shù)據(jù)偏高，因此，急需一種實(shí)用、高效的分析手段，能夠?qū)@類結(jié)構(gòu)類似物進(jìn)行有效的區(qū)分和鑒別。常規(guī)分析方法如液相、質(zhì)譜等[14]要經(jīng)過復(fù)雜的分離手段，操作復(fù)雜、耗時(shí)長，給臨床監(jiān)測帶來諸多不便。筆者利用SERS技術(shù)對(duì)3種結(jié)構(gòu)類似物進(jìn)行了有效的區(qū)分，并極大地降低了三者的檢測限，同時(shí)，在實(shí)際血清樣品的鑒別中也得到了很好的應(yīng)用。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

DF-101S恒溫加熱磁力攪拌器（上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司）；Vortex-Genie2多功能旋渦混合器（美國 Scientific Industries公司）；TG16-WS離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)有限公司）；電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；BWS415-785H便攜式拉曼光譜儀（美國必達(dá)泰克公司）；TU-1902紫外可見分光計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；Zeiss EVO MA-10 掃描電子顯微鏡（德國Carl-Zeiss公司）；

1.2 試劑

黃嘌呤、茶堿、可可堿（分析純）購自上海泰坦科技股份有限公司；硝酸銀、檸檬酸三鈉、碘化鉀、甲醇（分析純）購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；血清樣品取自SD大鼠；去離子水為實(shí)驗(yàn)室自制。

2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

2.1 待測樣品的制備

10 μmol/L黃嘌呤溶液：用精度為十萬分之一的電子天平準(zhǔn)確稱取15.21 mg黃嘌呤粉末，溶于1 L去離子水中，攪拌均勻，待完全溶解后得到濃度為100 μmol/L的黃嘌呤儲(chǔ)備液。再利用去離子水按照濃度梯度稀釋，依次得到濃度為10、5、1、0.5、0.2、0.15、0.1、0.075 μmol/L 的黃嘌呤溶液。

10 μmol/L茶堿溶液：用精度為十萬分之一的電子天平準(zhǔn)確稱取18.16 mg茶堿粉末，溶于1 L去離子水中，攪拌均勻，待完全溶解后得到濃度為100 μmol/L的茶堿儲(chǔ)備溶液。再利用去離子水按照濃度梯度稀釋，依次得到濃度為10、5、1、0.5、0.2、0.15、0.1、0.075 μmol/L 的茶堿溶液。

10 μmol/L可可堿溶液：用精度為十萬分之一的電子天平準(zhǔn)確稱取18.16 mg可可堿粉末，溶于1 L去離子水中，攪拌均勻，待完全溶解后得到濃度為100 μmol/L的可可堿儲(chǔ)備溶液。再利用去離子水按照濃度梯度稀釋，依次得到濃度為10、5、1、0.5、0.2、0.15、0.1、0.075 μmol/L 的可可堿溶液。

1 μmol/L碘化鉀溶液：用精度為十萬分之一的電子天平準(zhǔn)確稱取碘化鉀粉末16.6 mg，溶于100 ml去離子水中，攪拌均勻，待完全溶解后即得1 mmol/L的碘化鉀溶液。

10 mmol/L硫酸鎂MgSO4溶液：用精度為十萬分之一的電子天平準(zhǔn)確稱取無水硫酸鎂粉末120 mg，溶于 100 ml去離子水中，攪拌均勻，待完全溶解后即得10 mmol/L的MgSO4溶液。

2.2 銀膠增強(qiáng)試劑的制備

用電子分析天平準(zhǔn)確稱取硝酸銀36 mg，用200 ml 的去離子水充分溶解，將該溶液緩慢倒入500 ml的三頸燒瓶中，不斷加熱的同時(shí)進(jìn)行磁力攪拌，溶液微沸時(shí)，加入4 ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的檸檬酸三鈉溶液，繼續(xù)加熱攪拌約1 h，溶液的顏色由無色變?yōu)榛揖G色，停止加熱，冷卻至室溫，倒入棕色瓶中，避光保存[15]。由于溶膠體系的不穩(wěn)定性，每次使用銀膠之前都要搖晃均勻。

2.3 納米銀膠顆粒的表征

紫外圖譜表征：取2 ml納米銀膠溶液離心（7 000 r/min，5 min），盡可能多地去除上清液，然后加入等量的去離子水，吹打混勻，再加入8 ml去離子水稀釋5倍，最后在300～700 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行紫外光譜掃描，觀察物質(zhì)的紫外特征吸收峰。

掃描電鏡表征：取 1 ml銀膠溶液離心（7 000 r/min，5 min），盡可能多地去除上清液，然后加入1 ml去離子水，吹打混勻后，用移液槍吸取 2.5 μl銀膠溶液滴于硅片上，烘干后電鏡掃描，觀察納米銀膠顆粒的形態(tài)。

2.4 銀膠背景信號(hào)的去除

本實(shí)驗(yàn)為了增加單位面積內(nèi)SERS檢測的“熱點(diǎn)”數(shù)目，對(duì)銀膠溶液進(jìn)行了濃縮處理。結(jié)果發(fā)現(xiàn)濃縮約60倍的銀膠溶液信號(hào)增強(qiáng)效果最好，但是卻產(chǎn)生了極強(qiáng)的背景信號(hào)，推測可能是由于制備銀膠溶液時(shí)殘留的檸檬酸根導(dǎo)致的。根據(jù)任斌課題組的方法[16]，我們用碘化鉀溶液對(duì)銀膠表面進(jìn)行清洗。首先用移液槍分別吸取10 μl濃縮后的銀膠溶液，置于6個(gè)1.5 ml離心管中，然后向每個(gè)離心管中分別加入 0、1、3、5、7、9 μl的碘化鉀溶液，渦旋混勻后，室溫下孵育20～30 min采集SERS光譜。觀察當(dāng)多少碘化鉀用量可使銀膠濃縮后的背景信號(hào)基本去除。

2.5 光譜檢測條件

本實(shí)驗(yàn)所有SERS圖譜均由BWS415拉曼光譜儀測得，將待測體系加到96孔板中，置于拉曼顯微系統(tǒng)的檢測臺(tái)上，檢測過程中，96孔板保持水平的狀態(tài)，打開激光，將激光聚焦于待測溶液表面，點(diǎn)擊開始，然后進(jìn)行SERS檢測。

光譜檢測參數(shù)如下：激光波長785 nm，分辨率5 cm-1，積分時(shí)間 10 s，掃描次數(shù)為 1 次，激光功率為 100 mW。

2.6 黃嘌呤、茶堿、可可堿的 SERS 光譜采集

用移液槍吸取10 μl濃縮60倍后的銀膠溶液置于 1.5 ml離心管中，向其中加入 5 μl 1 mmol碘化鉀溶液，渦旋混勻后，室溫下孵育20～30 min。然后加入 10 μl 100 mmol的黃嘌呤（茶堿/可可堿）溶液和2 μl的MgSO4溶液（這里Mg2+的加入是為了對(duì)銀膠顆粒起到團(tuán)聚作用，以達(dá)到增強(qiáng)檢測信號(hào)的目的），吹打混勻后，加入去離子水，使最終的溶液體積為 100 μl。此時(shí)，黃嘌呤（茶堿/可可堿）的最終檢測濃度均為10 mmol/L，然后將溶液轉(zhuǎn)移到96孔板中，放到檢測臺(tái)上，打開激光，采集SERS圖譜。SERS檢測步驟如圖1所示。

圖 1 SERS 檢測流程圖

2.7 黃嘌呤、茶堿、可可堿的 SERS檢測限測定

按照上述SERS檢測的步驟，分別對(duì)已經(jīng)配好的 10、5、1、0.5、0.2、0.15、0.1、0.075 μmol/L 的黃嘌呤、茶堿、可可堿溶液進(jìn)行檢測，測定3種結(jié)構(gòu)類似物的最低檢測限。

2.8 黃嘌呤、茶堿、可可堿混合物的血液檢測

從SD大鼠眼眶中獲取適量全血樣品溶液，等比例加入黃嘌呤、茶堿、可可堿粉末，混合均勻后，按照1:3的比例加入純甲醇溶液，用以沉淀蛋白，獲得包含3種物質(zhì)的血清樣品溶液。按照上述拉曼檢測步驟對(duì)3種物質(zhì)的血清體系進(jìn)行檢測。

2.9 數(shù)據(jù)處理方法

采用BWSpec4軟件對(duì)采集到的光譜原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，主要為光譜平滑和基線校正。然后利用Matlab軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行光譜波段的截取，選取400～1 800 cm-1處的光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，同時(shí)采用Origin 9軟件對(duì)處理好的數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

3.1 納米銀膠表征結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)采用的制膠方法來源于Lee法，是銀膠最經(jīng)典的制備方法。大多數(shù)實(shí)驗(yàn)的銀膠制備方法都在Lee法的基礎(chǔ)上加以進(jìn)一步的改進(jìn)和優(yōu)化，所以，不同實(shí)驗(yàn)室制備的納米銀膠在粒徑、形態(tài)大小上略有不同。本實(shí)驗(yàn)利用紫外光譜和掃描電鏡對(duì)納米銀膠顆粒進(jìn)行表征，結(jié)果如圖2所示。由圖2A可見，納米銀膠在300～700 nm掃描范圍內(nèi)，只在419 nm處出現(xiàn)了一個(gè)尖銳的單峰，半峰寬較窄。驗(yàn)證本實(shí)驗(yàn)制備的溶液確實(shí)為銀膠溶液，且較小的半峰寬也可以反映出納米銀顆粒具有良好的分散性和均一性[17-18]。圖2B可以看出本實(shí)驗(yàn)制備的納米銀膠顆粒為球形，大小均一，直徑約為60 nm，分布較為松散。而圖2C是將銀膠溶液濃縮之后的納米銀膠顆粒形態(tài)，相比于未濃縮的銀納米顆粒，濃縮之后粒子之間距離極大縮短，單位面積之內(nèi)的粒子數(shù)目增加，SERS檢測“熱點(diǎn)”也隨之增加，極大地提高了待測物質(zhì)的信號(hào)強(qiáng)度。

圖 2 銀納米顆粒表征結(jié)果

3.2 背景信號(hào)的去除

為了增強(qiáng)待測物質(zhì)的信號(hào)強(qiáng)度，提高SERS檢測的靈敏度，本實(shí)驗(yàn)將銀膠溶液通過離心的方式進(jìn)行了濃縮。經(jīng)過一系列濃縮倍數(shù)的嘗試，發(fā)現(xiàn)當(dāng)濃縮倍數(shù)為60倍左右時(shí)，信號(hào)增強(qiáng)效果最好。但是，與此同時(shí)，制備銀膠溶液時(shí)殘留在溶液里的檸檬酸根離子也隨之富集，顯示了強(qiáng)大的背景信號(hào)，嚴(yán)重掩蓋了待測物質(zhì)的信號(hào)。所以，本實(shí)驗(yàn)采用碘化鉀溶液對(duì)銀納米顆粒表面進(jìn)行清洗。由圖3可知，當(dāng) 1 mmol/L碘化鉀溶液用量為 5 μl時(shí)，背景信號(hào)基本去除干凈。碘化鉀用量不宜過多，因?yàn)檫^量的I-也會(huì)屏蔽待測物質(zhì)的信號(hào)，所以，碘化鉀用量為剛好去除背景信號(hào)即可。之后的所有實(shí)驗(yàn)都會(huì)對(duì)濃縮后的銀膠溶液經(jīng)歷KI清洗步驟，以保證待測物質(zhì)信號(hào)不受背景信號(hào)干擾，同時(shí)也不會(huì)被I-屏蔽。

圖 3 加入不同體積碘化鉀后銀膠的背景信號(hào)

3.3 黃嘌呤、茶堿、可可堿的SERS光譜結(jié)果分析

黃嘌呤、茶堿、可可堿是3個(gè)結(jié)構(gòu)十分相似的化合物，其中，茶堿、可可堿與黃嘌呤是同系物，而茶堿與可可堿之間是同分異構(gòu)體，如圖4所示。所以在實(shí)際應(yīng)用中，對(duì)于三者的鑒定檢測十分困難。通過SERS特有的指紋圖譜特性，可以對(duì)三者進(jìn)行很好的區(qū)分。由圖5可知，黃嘌呤的特征峰主要出現(xiàn)在 400～800 cm-1處，其中，522、577、660 cm-1處峰強(qiáng)明顯；茶堿的特征峰主要出現(xiàn)在400～600 cm-1以及 1 300～1 700 cm-1處，其中，520、567、932、1 306、1 380、1 440、1 587 cm-1峰強(qiáng)明顯；而可可堿出峰較多，在 400～1 800 cm-1均有出峰，其中，474、639、698、1 316、1 355、1 594 cm-1峰強(qiáng)較高。由此可見，盡管3種物質(zhì)的結(jié)構(gòu)十分類似，但是在SERS圖譜中的特征峰卻完全不同。所以SERS技術(shù)對(duì)于這類結(jié)構(gòu)類似物具有很好的區(qū)分效果。

圖 4 黃嘌呤、茶堿、可可堿的結(jié)構(gòu)式

3.4 黃嘌呤、茶堿、可可堿的檢測限測定結(jié)果

上述對(duì)銀膠溶液進(jìn)行濃縮，不僅是為了增強(qiáng)待測物質(zhì)的信號(hào)強(qiáng)度，同時(shí)也有降低檢測限的目的?，F(xiàn)利用濃縮銀膠對(duì)3種物質(zhì)檢測限分別測定，由圖6可知，黃嘌呤和可可堿的最低檢測限為0.075 μmol/L，而茶堿的最低檢測限為 0.1 μmol/L，相比于液相等方法[19-21]，該方法對(duì)三者的檢測靈敏度更高，檢測限更低，完全能滿足實(shí)際應(yīng)用中對(duì)3種物質(zhì)含量的檢測。

3.5 黃嘌呤、茶堿、可可堿混合物的血液檢測結(jié)果

黃嘌呤、茶堿以及可可堿都是常見藥物成分，臨床上常對(duì)3種物質(zhì)的血藥濃度進(jìn)行監(jiān)測。但是三者之間互為結(jié)構(gòu)類似物，常常對(duì)監(jiān)測過程產(chǎn)生干擾，使得測定結(jié)果偏高，故而本實(shí)驗(yàn)利用SERS技術(shù)對(duì)3種物質(zhì)同時(shí)存在的血清溶液進(jìn)行測定，觀察SERS圖譜是否可以很好地將其區(qū)別開來。結(jié)果如圖7所示。由圖7A可知，單獨(dú)對(duì)血清空白樣品進(jìn)行檢測，是沒有SERS信號(hào)產(chǎn)生的。表明血清體系不對(duì)測定結(jié)果產(chǎn)生干擾。而含有3種物質(zhì)的血清樣品溶液可以檢測到三者的特征信號(hào)。盡管信號(hào)強(qiáng)度對(duì)比水溶液來說弱了許多，但是與圖7B對(duì)比可知，3種物質(zhì)的特征峰均可以在混合血清溶液中一一對(duì)應(yīng)。以上表明，利用SERS技術(shù)可以有效檢測血清樣品中是否包含黃嘌呤、茶堿、可可堿中一個(gè)或多個(gè)物質(zhì)的存在。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)利用SERS技術(shù)對(duì)結(jié)構(gòu)類似物黃嘌呤、茶堿、可可堿進(jìn)行測定。結(jié)果表明，盡管3種物質(zhì)在結(jié)構(gòu)上相差不大，但是其各自的SERS圖譜卻完全不同，特征峰各異，可以很好的區(qū)分。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程操作簡單、耗時(shí)短、樣品需求少，證明了SERS技術(shù)對(duì)結(jié)構(gòu)類似物具有很好的區(qū)分鑒別作用。同時(shí)，我們通過將SERS技術(shù)應(yīng)用到檢測3種物質(zhì)的血清樣品溶液中，證明該方法可以有效地對(duì)三者混合物進(jìn)行鑒定。綜上，SERS在對(duì)結(jié)構(gòu)類似物進(jìn)行定性鑒別等方面具有巨大優(yōu)勢。

圖 5 10 μmol/L 黃嘌呤（A）、茶堿（B）、可可堿（C）及三者對(duì)比（D）SERS 圖譜

圖 6 黃嘌呤（A）、茶堿（B）、可可堿（C）的檢測限

圖 7 混合3種物質(zhì)的血清SERS圖譜與3種物質(zhì)水溶液SERS圖譜對(duì)比