張 靜，袁宇琳，熊 雯（成都市食品藥品檢驗(yàn)研究院，四川 成都 610000）

卡馬西平（carbamazepine，CBZ）為三環(huán)類抗癲癇藥物，是治療癲癇單純及復(fù)雜部分性發(fā)作的首選藥之一，在臨床上被廣泛應(yīng)用。由于卡馬西平治療窗窄，個(gè)體差異大，在臨床上常需要進(jìn)行治療藥物監(jiān)測(cè)（therapeutic drug monitoring，TDM）以保證藥物治療的安全性和有效性[1]。為提高藥代動(dòng)力學(xué)生物樣品檢測(cè)質(zhì)量，衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心（以下簡(jiǎn)稱臨檢中心）自2014年起，在全國范圍內(nèi)開展藥代動(dòng)力學(xué)檢驗(yàn)室間質(zhì)量評(píng)價(jià)活動(dòng)（以下簡(jiǎn)稱室間質(zhì)評(píng)），評(píng)價(jià)項(xiàng)目為人血漿中CBZ的濃度測(cè)定[2]。本研究建立并驗(yàn)證了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）測(cè)定人血漿中CBZ濃度方法，本方法特異性好，精密度高，準(zhǔn)確度好，使用該方法測(cè)定的室間質(zhì)評(píng)樣品結(jié)果順利通過了考核，可供參與此項(xiàng)室間質(zhì)評(píng)的相關(guān)實(shí)驗(yàn)室參考。

1 資料與方法

1.1 試藥試劑

卡馬西平對(duì)照品（EDQM，批號(hào)：006539，含量：99.9%），卡馬西平-d8（carbamazepine-d8, CBZ-d8）對(duì)照品（加拿大TRC公司，批號(hào)：18-MVI-22-3，含量：96%），乙腈、甲酸為色譜純級(jí)，水為超純水，空白人血漿購自Bioreclamation IVT公司（抗凝劑為K2EDTA）。

1.2 儀器

LC-30A型超高效液相色譜儀（日本島津公司），Triple Quad 5500質(zhì)譜儀（美國Applied Biosystems公司），XPE105型電子分析天平（法國METTLER TOLEDO公司），5810R型超速離心機(jī)（德國Eppendorf公司），VORTEX-T GENIE 2型旋渦混合器（美國SCIENTIFIC INDUSTRIES公司）。

1.3 色譜與質(zhì)譜條件

色譜柱為Waters Xselsect?CSHTMC18柱（75 mm×2.1 mm，2.5 μm），流動(dòng)相A為含0.05%甲酸的水溶液，流動(dòng)相B為含0.05%甲酸的乙腈溶液，梯度洗脫（0→0.8 min，A：95%→2%；0.8→2.0 min，A：2%；2.0→2.2 min，A：2%→95 %；2.2→3.1 min，A：95%），流速0.3 mL·min-1，柱溫40 ℃。

采用電噴霧離子源（ESI），多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）正離子模式。離子源溫度500 ℃，離子噴霧電壓5500 V，輔助加熱氣壓力50 psi，霧化氣壓力50 psi，氣簾氣壓力35 psi，碰撞氣9 psi，去簇電壓10 V，碰撞電壓28 V。用于定量分析的離子對(duì)分別為：m/z237.1→194.1（CBZ），m/z245.0→202.1（CBZ-d8）。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)品溶液和內(nèi)標(biāo)溶液的配制

精密稱取CBZ對(duì)照品10 mg，用乙腈溶解并定容至100 mL，得濃度為100 μg·mL-1的CBZ儲(chǔ)備液；取CBZ儲(chǔ)備液加水進(jìn)行稀釋，配得所需濃度的系列CBZ標(biāo)準(zhǔn)工作液。

取CBZ-d8對(duì)照品1 mg（一個(gè)包裝），用乙腈溶解并定容至100 mL，得濃度為10 μg·mL-1的CBZ-d8儲(chǔ)備液；取CBZ-d8儲(chǔ)備液加水進(jìn)行稀釋，配得CBZ-d8濃度為500 ng·mL-1的內(nèi)標(biāo)工作液。

1.5 血漿樣品的處理方法

取血漿樣品50 μL，加入10 μL內(nèi)標(biāo)工作液，旋渦混合15 s后，再加入340 μL乙腈，旋渦混合30 s后，于12 000 g、4 ℃離心10 min，吸取上清液20 μL，再加入0.05%甲酸水溶液380 μL稀釋，旋渦混合15 s，取100 μL至進(jìn)樣瓶中，進(jìn)樣2 μL。

2 結(jié)果

2.1 方法的選擇性

在本實(shí)驗(yàn)條件下，考察了6個(gè)來源的血漿，結(jié)果顯示6個(gè)來源的血漿在CBZ和內(nèi)標(biāo)出峰處均無內(nèi)源性物質(zhì)干擾，CBZ及內(nèi)標(biāo)峰形良好，保留時(shí)間均為1.70 min。表明該方法選擇性良好，內(nèi)源性物質(zhì)不干擾測(cè)定。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及定量下限

用空白血漿加CBZ標(biāo)準(zhǔn)工作液，分別配制得到濃度為5、10、20、50、100、300、800、1000 ng·mL-1的血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品，按“1.5”項(xiàng)下進(jìn)行處理，進(jìn)樣分析。以CBZ濃度為橫坐標(biāo)（x），CBZ與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)（y），采用加權(quán)（1/x2）最小二乘法進(jìn)行線性回歸，CBZ連續(xù)3天的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程見表1。結(jié)果表明，CBZ在5～1000 ng·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)（r）范圍為0.999 3～0.999 9。

配制定量下限濃度的血漿樣品6份，按“1.5”項(xiàng)下進(jìn)行處理，進(jìn)樣分析，連續(xù)測(cè)定3 d。批內(nèi)精密度為2.66%～4.10%，批內(nèi)準(zhǔn)確度為101.05%～106.33%，批間精密度為3.71%，批間準(zhǔn)確度為103.38%。

表1 線性回歸方程Tab 1 Linear regression equation

2.3 殘留

在標(biāo)準(zhǔn)曲線最高濃度（1000 ng·mL-1）血漿樣品進(jìn)樣后，再進(jìn)樣空白樣品以評(píng)價(jià)殘留效應(yīng)。測(cè)定結(jié)果為卡馬西平的峰面積低于定量下限的20%，內(nèi)標(biāo)峰面積低于樣品的5%，表明該方法殘留效應(yīng)小，殘留對(duì)分析無影響。

2.4 準(zhǔn)確度和精密度

配制4個(gè)濃度（15、50、500、750 ng·mL-1）的質(zhì)控血漿樣品各6份，按“1.5”項(xiàng)下進(jìn)行處理，進(jìn)樣分析，連續(xù)測(cè)定3 d，計(jì)算批內(nèi)、批間準(zhǔn)確度和精密度見表2。結(jié)果表明，該方法批內(nèi)和批間準(zhǔn)確度和精密度良好。

表2 批內(nèi)、批間精密度和準(zhǔn)確度.n=6Tab 2 Intra-day and inter-day precisions and accuracies.n=6

2.5 基質(zhì)效應(yīng)

取6個(gè)不同來源的血漿，按“1.5”項(xiàng)下進(jìn)行處理獲得空白上清液，分別加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制4個(gè)濃度（15、50、500、750 ng·mL-1）的血漿樣品各3份，進(jìn)樣分析，記錄峰面積為AM。用水代替血漿加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液配得相應(yīng)的溶液樣品，進(jìn)樣分析，記錄峰面積為AW?；|(zhì)效應(yīng)=AM/AW×100 %，內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)效應(yīng)=CBZ基質(zhì)效應(yīng)/內(nèi)標(biāo)基質(zhì)效應(yīng)×100%。結(jié)果見表3，6種不同來源的血漿CBZ和內(nèi)標(biāo)基質(zhì)效應(yīng)均較小，表明該方法基質(zhì)效應(yīng)小，血漿基質(zhì)不干擾測(cè)定。

2.6 回收率

配制4個(gè)濃度（15、50、500、750 ng·mL-1）的質(zhì)控血漿樣品各6份，按“1.5”項(xiàng)下進(jìn)行處理，進(jìn)樣分析，記錄峰面積為AE。取空白血漿按“1.5”項(xiàng)下處理獲得空白上清液，分別加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制相應(yīng)濃度的的血漿樣品各6份，進(jìn)樣分析，記錄峰面積為AS?；厥章?AE/AS×100%。結(jié)果顯示，CBZ濃度為15、50、500、750 ng·mL-1時(shí)，回收率依次為97.77%、102.02%、98.74%、100.89%，內(nèi)標(biāo)（500 ng·mL-1）回收率為99.13%，表明該方法回收率良好。

2.7 稀釋驗(yàn)證

配制濃度為1500 ng·mL-1的血漿樣品各6份，用空白血漿稀釋2倍得到濃度為750 ng·mL-1的質(zhì)控血漿樣品，按“1.5”項(xiàng)下進(jìn)行處理，進(jìn)樣分析。稀釋2倍的血漿樣品與理論值的準(zhǔn)確度偏差為–1.33%，RSD為2.22%，表明樣品稀釋2倍測(cè)定不影響該方法的精密度與準(zhǔn)確度。

2.8 穩(wěn)定性和進(jìn)樣重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

配制濃度為15、750 ng·mL-1的質(zhì)控血漿樣品各6份，分別考察血漿樣品2次凍融（–80 ℃冷凍，取出后室溫解凍，重復(fù)2次）、室溫放置（日光，6 h）、進(jìn)樣室放置（10 ℃，11 h）穩(wěn)定性和自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣3次重復(fù)性。將處理后樣品的測(cè)定結(jié)果與理論濃度進(jìn)行比較，結(jié)果見表4。結(jié)果表明，血漿樣品反復(fù)凍融2次、室溫放置6 h和進(jìn)樣室放置11 h均穩(wěn)定，自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣重復(fù)性良好。

表3 CBZ和內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)效應(yīng).±s，n=3Tab 3 Matrix effects of carbamazepine and internal standard.±s，n=3

表3 CBZ和內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)效應(yīng).±s，n=3Tab 3 Matrix effects of carbamazepine and internal standard.±s，n=3

基質(zhì)編號(hào)內(nèi)標(biāo)基質(zhì)效應(yīng)/%01 104.47±1.62 101.19±1.68 102.45±1.31 101.76±0.73 103.22±0.13 099.87±0.25 107.12±2.10 106.42±1.01 103.23±0.53 02 103.66±0.68 100.37±0.59 102.74±0.22 102.80±1.32 104.93±0.93 100.67±0.20 109.18±1.98 107.43±3.16 103.26±0.67 03 103.01±1.46 100.62±0.68 102.29±0.46 102.81±0.74 103.07±0.70 101.08±0.20 107.32±2.45 106.59±2.55 102.37±1.55 04 100.96±1.45 100.07±1.40 100.36±0.70 101.65±0.68 102.95±0.41 101.47±0.58 106.46±1.94 107.60±1.28 100.88±0.06 05 100.93±0.90 099.83±0.78 099.08±0.78 101.77±0.69 101.10±1.70 100.80±0.73 102.09±2.83 104.05±1.17 101.10±0.75 06 100.69±0.98 100.76±0.28 099.43±0.56 102.61±0.49 100.09±0.41 100.26±0.25 103.88±1.52 106.76±1.63 099.93±1.03 750 ng·mL-1 500 ng·mL-1 75 ng·mL-1 15 ng·mL-1 500 ng·mL-1 CBZ基質(zhì)效應(yīng)/%CBZ內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)效應(yīng)因子/%CBZ基質(zhì)效應(yīng)/%CBZ內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)效應(yīng)因子/%CBZ基質(zhì)效應(yīng)/%CBZ內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)效應(yīng)因子/%CBZ基質(zhì)效應(yīng)/%CBZ內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)效應(yīng)因子/%

表4 樣品穩(wěn)定性和進(jìn)樣重復(fù)性結(jié)果.±s，n=6Tab 4 Results of sample stability and injection reproducibility.±s，n=6

表4 樣品穩(wěn)定性和進(jìn)樣重復(fù)性結(jié)果.±s，n=6Tab 4 Results of sample stability and injection reproducibility.±s，n=6

理論濃度/ng·mL-1凍融2次 室溫放置6 h 進(jìn)樣室放置11 h 重復(fù)進(jìn)樣3次準(zhǔn)確度/% CV/% 準(zhǔn)確度/% CV/% 準(zhǔn)確度/% CV/% 準(zhǔn)確度/% CV/%15 096.4±2.21 2.30 097.49±1.30 1.33 96.06±3.17 3.30 94.45±3.42 3.62 750 102.49±0.59 0.58 101.28±1.82 1.80 99.99±1.12 1.12 99.99±0.64 0.64

2.9 質(zhì)控樣品測(cè)定

按“1.5”項(xiàng)下處理臨檢中心送檢的5個(gè)未知濃度CBZ血漿樣品，進(jìn)樣分析，具體結(jié)果見表5。質(zhì)評(píng)結(jié)果表明，所有質(zhì)評(píng)樣品測(cè)定結(jié)果均在允許范圍內(nèi)。

表5 室間質(zhì)評(píng)中5個(gè)樣品的測(cè)定結(jié)果Tab 5 Results of 5 samples in external quality assessment

3 討論

3.1 現(xiàn)狀

目前，文獻(xiàn)報(bào)道的卡馬西平血藥濃度測(cè)定方法主要有免疫分析法[3]、高效液相色譜-紫外（HPLC-UV）法[4-5]、高效液相色譜-二極管陣列（HPLC-DAD）法[6]和液質(zhì)聯(lián)用法[7]。

其中，免疫分析法操作簡(jiǎn)便快速、自動(dòng)化程度高，適用于臨床急癥的快速分析；但選擇性不佳，代謝物易干擾藥物濃度的測(cè)定，且依賴于進(jìn)口試劑盒，分析成本較高。HPLC-UV法和HPLC-DAD法選擇性強(qiáng)、靈敏度高，但分析物和干擾物質(zhì)必須達(dá)到色譜分離才能準(zhǔn)確定量，方法開發(fā)時(shí)對(duì)預(yù)處理和色譜條件要求較高，且靈敏度低于液質(zhì)聯(lián)用法；謝燕如等[8]報(bào)道的反相高效液相色譜法測(cè)定人血漿中卡馬西平濃度，其定量下限為1000 ng·mL-1，單個(gè)樣品分析時(shí)間為7 min。液質(zhì)聯(lián)用法較HPLC法分析時(shí)間更短，選擇性更好，靈敏度更高，孫曉清等[9]報(bào)道的UPLC-MS/MS法同時(shí)檢測(cè)人血漿中卡馬西平和苯巴比妥濃度，卡馬西平定量下限可達(dá)10 ng·mL-1，單個(gè)樣品分析時(shí)間為3 min。本研究確定的液-質(zhì)聯(lián)用法定量下限為5 ng·mL-1，單個(gè)樣品分析時(shí)間為3.1 min，操作簡(jiǎn)便快速、專屬性好、靈敏度高，適用于低濃度樣品的快速測(cè)定。

3.2 條件優(yōu)化

本研究在選擇流動(dòng)相時(shí)，考察了不同水相：0%、0.05%、0.10%、0.20%濃度的甲酸水溶液，不同有機(jī)相：甲醇、乙腈以及含不同濃度甲酸的甲醇、乙腈溶液，最終確定水相為含0.05%甲酸的水溶液，有機(jī)相為含0.05%甲酸的乙腈溶液進(jìn)行梯度洗脫，分析時(shí)間為3.1 min，色譜峰形良好，無內(nèi)源性物質(zhì)干擾，分析時(shí)間短。在開發(fā)樣品預(yù)處理方法時(shí)，考察了不同沉淀劑及體積，顯示乙腈沉淀效果優(yōu)于甲醇，優(yōu)化得到的乙腈加入體積既保證沉淀效果也保證待測(cè)物響應(yīng)。沉淀后上清液中加入0.05%甲酸水溶液作為稀釋液，可以降低生物基質(zhì)對(duì)質(zhì)譜檢測(cè)器的干擾，同時(shí)水相的加入大大改善了色譜峰形。本研究采用CBZ-d8為內(nèi)標(biāo)，內(nèi)標(biāo)與待測(cè)物結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)相似，在處理過程中提取率一致、質(zhì)譜響應(yīng)相似，使得該方法重現(xiàn)性良好，批內(nèi)和批間精密度和準(zhǔn)確度良好，回收率高，基質(zhì)效應(yīng)低。

3.3 室間質(zhì)評(píng)結(jié)果分析

通過建立的方法測(cè)定5個(gè)質(zhì)評(píng)樣品全部通過，且與靶值偏差小于4.5%，表明該方法結(jié)果準(zhǔn)確可靠。分析質(zhì)評(píng)結(jié)果可知，實(shí)測(cè)值較理論值存在正偏差，提示該方法可能存在一定的系統(tǒng)誤差，也可能為質(zhì)評(píng)樣品在運(yùn)輸和存放過程水分減少樣品濃縮導(dǎo)致。同時(shí)，質(zhì)評(píng)結(jié)果還顯示高濃度樣品的偏差較低濃度更大，可能是由于線性擬合時(shí)采用加權(quán)（1/x2）最小二乘法，使得擬合方程時(shí)更偏重于低濃度導(dǎo)致。

綜上，本研究建立并驗(yàn)證了UPLC-MS/MS法測(cè)定人血漿中CBZ濃度，該方法簡(jiǎn)單快速、靈敏度高、特異性好、重現(xiàn)性好，符合臨檢中心關(guān)于藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物樣品檢測(cè)的要求，尤其適用于低濃度血漿樣品的快速分析，可應(yīng)用于室間質(zhì)評(píng)、TDM及人體生物藥代動(dòng)力學(xué)樣品測(cè)定。