師景雙，袁 超，程月紅，厲玉婷，李 靜，任雪梅*

（1.山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東 濟(jì)南 250101；2.山東省藥學(xué)科學(xué)院 山東省生物藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南 250101）

蛹蟲草（Cordyceps militaris），又名北蛹蟲草、北蟲草[1]。蛹蟲草含蟲草多糖、蟲草酸、蟲草素、黃酮及甾醇等多種活性成分[2-3]。蛹蟲草多糖具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)和抑制腫瘤細(xì)胞生長等諸多生理功能[4-6]。本文對蛹蟲草多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并對其體外抗氧化活性進(jìn)行了研究，以期為蛹蟲草多糖的開發(fā)研究提供參考和依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

MS204TS分析天平（梅特勒-托利多）；SHA-B水浴恒溫振蕩器（金壇醫(yī)療儀器廠）；TG16-WS離心機(jī)（萬豐儀器制造公司）；UV-2700紫外可見分光光度計(jì)（日本島津）；R-300旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士步琦公司）。

1.2 材料與試劑

人工蛹蟲草（市售）；KH2PO4，F(xiàn)eSO4，F(xiàn)eCl3，鐵氰化鉀，水楊酸，雙氧水，抗壞血酸，三氯乙酸，95 %乙醇，無水乙醇，葡萄糖，硫酸，蒽酮（分析純，國藥集團(tuán)）；1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，上海阿拉丁）；蒽酮試劑：精密稱取蒽酮0.1 g，加80 %濃硫酸100 ml溶解，搖勻，當(dāng)日配制使用。

2 方法

2.1 葡萄糖對照品溶液配制

將無水葡萄糖置于烘箱中，105 ℃干燥恒重。準(zhǔn)確稱取100 mg，用蒸餾水定容至100 ml，得對照品母液。取10 ml母液定容至100 ml，得0.1 mg/ml葡萄糖對照品溶液。

2.2 提取工藝

將蛹蟲草粉碎過篩，取篩下物，加熱水提取，提取完畢后收集濾液，殘?jiān)俅翁崛?0 min，合并濾液，真空濃縮至固形物含量25 %～30 %后，加入3倍體積95 %乙醇沉淀多糖，4 ℃靜置24 h，5000 r/min離心15 min，無水乙醇洗脫，冷凍干燥，得蛹蟲草多糖。

2.3 蟲草多糖的測定

分別吸取0.1 mg/ml葡萄糖對照品溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 ml，置于10 ml具塞比色管中，補(bǔ)充水至2.0 ml，加入蒽酮硫酸溶液6.0 ml，混勻，置沸水浴中加熱15 min，取出，立即置于冰浴中冷卻15 min，取出，空白管調(diào)零，625 nm測定吸光度[7]，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

將粗多糖用蒸餾水溶解，定容于100 ml 量瓶，搖勻，得待測母液。將待測母液進(jìn)行適宜倍數(shù)稀釋，取稀釋液1 ml，置于10 ml具塞比色管中，采用與標(biāo)準(zhǔn)曲線相同的操作步驟測定，按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖含量，按下式計(jì)算多糖提取率。

多糖提取率（%）=測得的多糖含量×稀釋倍數(shù)/蛹蟲草菌粉質(zhì)量×100

2.4 單因素實(shí)驗(yàn)

選取菌粉粒度、料液比、提取溫度、提取時(shí)間、提取次數(shù)5因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，初步選定菌粉粒度80目、料液比1：15、提取溫度70 ℃、提取時(shí)間2 h及提取次數(shù)1次為基本條件，改變其中一個(gè)條件，固定其他條件來考察各因素對蛹蟲草多糖提取率的影響，以確定較優(yōu)條件。其中菌粉粒度分別設(shè)為40，60，80，100目，料液比分別設(shè)為1：10，1：15，1：20，1：25，提取溫度分別設(shè)為50，60，70，80 ℃，提取次數(shù)分別設(shè)為1，2，3，4次。

2.5 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對料液比、提取溫度、提取時(shí)間、提取次數(shù)這4個(gè)因素進(jìn)行4因素3水平的正交實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步優(yōu)化提取條件，并根據(jù)正交試驗(yàn)得出的優(yōu)化條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

2.6 體外抗氧化效果測定

2.6.1 蛹蟲草多糖清除DPPH 自由基效果檢測DPPH乙醇溶液本身為紫色，且在517 nm波長處有強(qiáng)烈吸收，加入抗氧化劑后其顏色變淺，以在517 nm波長處吸光度的下降值表示抗氧化劑對DPPH自由基的清除能力[8-9]。參考李志平等[10]的方法，略作改動(dòng)，于具塞試管中加入 DPPH乙醇溶液（0.2 mmol/l）1 ml，分別加入不同濃度的樣品溶液1 ml，混勻，室溫下避光靜置30 min，517 nm處測定吸光度值，同時(shí)選取抗壞血酸為作為陽性對照，DPPH自由基的清除率按以下公式計(jì)算。

式中，A0為空白樣品吸光度值，A1為加樣后的吸光度值，A2為以蒸餾水代替DPPH的吸光度值。

2.6.2 蛹蟲草多糖清除羥自由基效果測定 羥自由基是機(jī)體代謝產(chǎn)物，是機(jī)體內(nèi)起主要作用的自由基之一。參考邵雙雙等[11]的方法，向2 ml不同濃度的樣品溶液中加入6mmol/L FeSO4溶液2 ml，混勻后加入6 mmol/L H2O2溶液2 ml，搖勻，靜置10 min，加入6 mmol/L水楊酸2 ml，混勻后再次靜置10 min，于510 nm 處測定吸光度值。同時(shí)選取抗壞血酸為作為陽性對照，按下式計(jì)算羥自由基的清除率。

式中，A0為空白樣品吸光度值，A1為加樣后吸光度值，A2為以蒸餾水代替H2O2溶液的吸光度值。

3 結(jié)果與分析

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

以葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算得回歸方程為A=0.0044C+0.0127，相關(guān)系數(shù)R2=0.9998。

3.2 單因素實(shí)驗(yàn)

3.2.1 菌粉粒度對蛹蟲草多糖提取率的影響 結(jié)果見圖1。原料粒度的大小決定原料的表面積，進(jìn)而影響與溶劑的接觸和傳質(zhì)過程，原料直徑愈小，溶劑與原料接觸愈充分，提取速度也就愈快。由圖1可見，菌粉粒度從40目到80目變化過程中，蛹蟲草多糖的提取率呈明顯上升趨勢，從80目到100目多糖提取率開始呈現(xiàn)緩慢下降趨勢，分析原因?yàn)椋?0目篩下物已完全達(dá)到蛹蟲草多糖提取所需的破碎程度，隨著破碎程度的增大，100目篩下物提取完畢后過濾阻力明顯增大，蛹蟲草粉壓實(shí)引起小部分多糖損失故多糖提取率開始呈下降趨勢，因此80目為蛹蟲草多糖提取的較優(yōu)菌粉粒度。

圖1 菌粉粒度對提取率的影響

3.2.2 料液比對蛹蟲草多糖提取率的影響 結(jié)果見圖2。料液比增大，可降低菌粉顆粒周圍多糖的濃度，增大細(xì)胞內(nèi)、外的滲透壓差，有利于蛹蟲草多糖的進(jìn)一步溶出。因此，實(shí)際生產(chǎn)中通?？煽紤]加大提取溶液的用量來獲得較高的提取率。由圖2可見，料液比從1：10提高至1：20的過程中，蛹蟲草多糖提取率的增大趨勢顯著，繼續(xù)提高料液比，提取率增大趨勢不再明顯。且過高的料液比會(huì)對后期的濃縮工序造成壓力，綜合考慮生產(chǎn)周期及經(jīng)濟(jì)成本等因素，一味通過提高料液比來增大提取率是不可取的，因此1：20為蛹蟲草多糖提取的較優(yōu)料液比。

圖2 料液比例對提取率的影響

3.2.3 提取溫度對蛹蟲草多糖提取率的影響 結(jié)果見圖3。隨著水浴溫度的升高，分子熱運(yùn)動(dòng)加快，細(xì)胞內(nèi)容物的穿透力增強(qiáng)，蛹蟲草多糖得率亦隨之增加。由圖3可見，溫度從50 ℃上升至70 ℃過程中，多糖提取率呈直線上升趨勢，70 ℃后增加趨勢開始較緩慢，這是由于蛹蟲草多糖是活性物質(zhì)，溫度過高易造成其結(jié)構(gòu)破壞，進(jìn)而影響其生物活性。因此綜合考慮70 ℃為蛹蟲草多糖的較優(yōu)提取溫度。

圖3 提取溫度對提取率的影響

3.2.4 提取時(shí)間對蛹蟲草多糖提取率的影響 結(jié)果見圖4。提取時(shí)間可直接影響蛹蟲草多糖的溶出，理論上講，時(shí)間越長，越有利于蛹蟲草多糖的溶出，但隨著提取時(shí)間的延長，細(xì)胞內(nèi)、外滲透壓逐漸趨于平衡，多糖進(jìn)入水溶液中的推動(dòng)力也在逐漸下降，長時(shí)間的熱提取也會(huì)造成一部分蛹蟲草多糖的降解。由圖4可見，當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到2 h時(shí)，多糖的提取率達(dá)峰值，2 h后多糖的提取率開始呈下降趨勢，綜合考慮能源損耗和節(jié)成本，2 h為蛹蟲草多糖的較優(yōu)提取時(shí)間。

圖4 提取時(shí)間對提取率的影響

3.2.5 提取次數(shù)對蛹蟲草多糖提取率的影響 結(jié)果見圖5。長時(shí)間的單次提取，不僅會(huì)造成多糖溶出效率降低，且提取出來的多糖還會(huì)發(fā)生部分降解。所以實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)多次提取方案，一次提取之后，將殘?jiān)尤?倍菌粉的蒸餾水，分別進(jìn)行2次、3次、4次提取。由圖5可見，3次提取后多糖的提取率基本不再發(fā)生變化，說明多糖已提取完全。故3次提取為蛹蟲草多糖的較優(yōu)提取次數(shù)。

圖5 提取次數(shù)對提取率的影響

3.3 正交試驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用L9（34）正交試驗(yàn)對料液比例、提取溫度、提取時(shí)間、提取次數(shù)這4個(gè)因素條件進(jìn)行優(yōu)化，因素水平表的設(shè)置見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

根據(jù)表1的設(shè)計(jì)進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

由正交試驗(yàn)結(jié)果可知，各因素對多糖提取率影響的主次順序?yàn)锳＞D＞B＞C，即料液比＞提取次數(shù)＞提取溫度＞提取時(shí)間；最佳提取條件為A2B1C2D3，即料液比1：20、提取溫度65 ℃、提取時(shí)間2 h、提取次數(shù)3次。在此條件下多糖提取率為10.42 %，與正交實(shí)驗(yàn)最優(yōu)組（第4組）相符。

3.4 體外抗氧化活性測定

3.4.1 DPPH自由基清除能力測定 結(jié)果見圖6。由圖6可見，隨著多糖和抗壞血酸濃度的增加，DPPH自由基的清除率呈上升趨勢，同濃度下抗壞血酸清除DPPH 自由基的能力更強(qiáng)；隨著濃度的增加，二者清除DPPH自由基能力的差距逐漸減小，當(dāng)濃度為1.2 mg/ml時(shí)，多糖對DPPH自由基的清除率為50.28 %，為同濃度下抗壞血酸的54.29 %。

圖6 多糖與抗壞血酸清除DPPH自由基效果

3.4.2 羥自由基清除能力 結(jié)果見圖7。由圖7可見，隨著多糖和抗壞血酸濃度的增加，羥自由基的清除率呈上升趨勢，當(dāng)多糖濃度在0.2～1.0 mg/ml范圍內(nèi)時(shí)，清除率增速明顯，同濃度下抗壞血酸清除羥自由基的能力更強(qiáng)；隨著濃度的增加，二者清除羥自由基能力的差距在逐漸減小，當(dāng)濃度為1.2 mg/ml時(shí)，多糖對羥自由基的清除率為60.29 %，為同濃度下抗壞血酸的65.69 %。

圖7 多糖與抗壞血酸清除羥自由基效果

4 結(jié)論

采用水提醇沉法提取蛹蟲草多糖，通過單因素實(shí)驗(yàn)、正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，得出最佳提取條件為菌粉粒度80目、料液比1：20、提取溫度65 ℃、提取時(shí)間2 h、提取次數(shù)3次，在此條件下，提取率達(dá)10.42 %。DPPH自由基和羥自由基清除能力反應(yīng)了多糖的抗氧化活性，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著濃度的增加，DPPH自由基和羥自由基的清除率呈上升趨勢，即多糖的抗氧化活性隨濃度的增大不斷增強(qiáng)。雖然同濃度下抗壞血酸的清除能力比多糖強(qiáng)，但是隨著濃度的增加二者的差距在不斷減小，當(dāng)濃度為1.2 mg/ml時(shí)，多糖對DPPH自由基、羥自由基的清除率分別為50.28 %，60.29 %，為同濃度下抗壞血酸的54.29 %，65.69 %。

陳安徽等[12]的研究表明，采用80 ℃一次提取，蛹蟲草多糖的提取率為9.31 %，對提取的多糖進(jìn)行清除DPPH自由基清除能力檢測，結(jié)果顯示當(dāng)多糖濃度為1.2 mg/ml時(shí)，清除率為29.45 %。本研究采用較低的水解溫度，進(jìn)行分次提取，不僅提高了多糖的提取率，且更好地保留了其抗氧化活性，為蛹蟲草多糖的開發(fā)利用奠定了一定的基礎(chǔ)。