陳小偉 程勇杰 蔣立新 崔艷麗 毛建衛(wèi)，3 沙如意*

（1 浙江科技學院生化學院 浙江省農產品化學與生物加工技術重點實驗室浙江省農業(yè)生物資源生化制造協(xié)同創(chuàng)新中心 杭州310023 2 浙江大學化學系 杭州310027 3 浙江工業(yè)職業(yè)技術學院 浙江紹興312000）

自由基（Free radical）在人體內由正常代謝產生，對細胞產生危害，能夠降低細胞抵抗力，引起線粒體的結構損傷，從而造成細胞老化，引起帕金森綜合癥，還能破壞碳水化合物、脂肪、蛋白質等結構構型，從而使人體免疫力下滑，動脈粥樣硬化，形成致癌物質等[1-2]。日益加快的生活節(jié)奏，使人們的飲食、運動皆受到影響，飲食不規(guī)律，長時間不運動等都會使人體內自由基積累，從而引起免疫力降低，患病率上升。

食用植物酵素（Edible Plant Jiaosu）具有自由基清除能力，對由人體內自由基積累過多引發(fā)的各種疾病有顯著的預防作用[3]。食用植物酵素不僅保留了植物原料中原有的功效成分，而且經過益生菌代謝作用，其中較難利用的活性物質被進一步降解，其次級代謝產物及部分小分子成分有利于機體的吸收與利用[4-5]。

草莓（Strawberry）為薔薇科（Rosaceae）植物[6]，目前主要以初級加工制品，如新鮮水果和草莓干等形式投放市場，存在產品開發(fā)價值低和附加值不高等問題。如將草莓加工成富含高營養(yǎng)價值的草莓酵素，則有利于草莓產業(yè)的轉型升級和高值化利用。研究發(fā)酵過程中代謝產物和抗氧化活性變化情況對草莓酵素發(fā)酵調控、品質控制和營養(yǎng)價值評價至關重要。

本文以草莓酵素為對象，研究不同發(fā)酵時間的總糖、總酸、檸檬酸、L-蘋果酸、醋酸、乳酸、總酚等活性成分的變化，檢測草莓酵素對3 種自由基（DPPH、羥基和ABTS）的清除效率，并考察其對還原力的影響，以期構建有關草莓酵素的綜合性指標評價體系，進而為草莓酵素的精準制備和發(fā)酵控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 材料 草莓：2017年3月采于浙江湖州；發(fā)酵用糖：由實驗室提供。

1.1.2 試劑 甲醇、蒽酮、福林酚（10 %）、三羥甲基氨基甲烷【（HOCH2）3CNH2】、雙氧 水（H2O2）、鐵氰化鉀、三氯化鐵，國藥集團化學試劑有限公司；三氯乙酸、2，2-聯(lián)氮基-雙-二胺鹽（ABTS）、抗壞血酸（VC），阿拉丁試劑有限公司（上海）；1，1-二苯基-2-苦苯肼（DPPH），TIC 公司。以上試劑均為分析純級。

檸檬酸標準物、醋酸標準物、乳酸標準物，阿拉丁試劑有限公司（上海）；DL-蘋果酸標準物，中國藥品生物制品檢定所。

1.1.3 儀器 PHS-3C 型酸度計，杭州齊威儀器有限公司；Waters e2695 液相色譜，美國Waters 公司；UV-5500 PC 型紫外分光光度計，上海元析儀器有限公司。50 L 316 L 型不銹鋼發(fā)酵罐，實驗室自制。

1.2 試驗方法

1.2.1 草莓酵素的制備 使用常溫無菌水輕輕沖洗草莓，自然瀝干，切片，按草莓與糖液質量比3∶4加入無菌發(fā)酵罐中，再加入適量酵液，于室溫條件下避光發(fā)酵，于發(fā)酵第10，20，30，50，75 和110天分別取樣，置于8 000 r/min 條件下，離心10 min，棄沉淀物，將得到的草莓酵素上清液置于-20 ℃保存，待測。

1.2.2 總糖含量的測定 參照張曉靜[7]的方法，采用蒽酮-H2SO4比色法分析不同發(fā)酵時間草莓酵素中的總糖。

1.2.3 總酸含量和pH 值的測定 總酸含量的測定：采用電位滴定法檢測不同發(fā)酵時間草莓酵素的總酸含量。根據(jù)滴定樣品稀釋液與檸檬酸溶液消耗的NaOH 溶液量，計算樣品中的總酸含量（檸檬酸當量）。

利用酸度計直接測定草莓酵素發(fā)酵液的pH。

1.2.4 特征性有機酸含量的測定 參照蔣增良等[8]的方法，采用HPLC 法檢測不同發(fā)酵時間草莓酵素的有機酸含量。

待測樣品的預處理：取草莓酵素樣品，用1.36 g/L KH2PO4緩沖液稀釋至一定的倍數(shù)，將稀釋液通過孔徑0.22 μm 的濾膜，透過液備用。

1.2.5 總酚含量的測定 參照蔣增良等[9]的方法，采用福林酚法檢測不同發(fā)酵時間草莓酵素的總酚含量。

1.2.6 DPPH 自由基清除能力的測定 參照沙如意等[10]的方法測定。

1.2.7 羥基自由基清除能力的測定 參照裴智山等[11]和Wang 等[12]的方法測定。

1.2.8 ABTS 自由基清除能力的測定 參照杜國榮等[13]的方法測定。

1.2.9 還原力的測定 參照Y?ld?r?m 等[14]的方法測定。

2 結果與討論

2.1 發(fā)酵過程中總糖含量的變化

采用硫酸-蒽酮法建立總糖的標準曲線，如圖1所示，相關系數(shù)R2=0.9990，說明當葡萄糖質量濃度為10～80 μg/mL 時，吸光度和濃度呈良好的線性擬合度。以糖類物質作為微生物發(fā)酵過程中的主要碳源，通過總糖含量變化分析微生物生長和代謝狀況。由圖2可知，在發(fā)酵的前30 d，總糖濃度呈顯著下降的趨勢，說明此階段微生物的生長比較旺盛，糖類物質主要用于微生物的增殖和合成代謝。發(fā)酵至第50 天，總糖含量降到0.38 g/mL，為發(fā)酵第10 天總糖濃度的46.02%，之后，總糖含量趨于穩(wěn)定并有緩慢增加的趨勢。發(fā)酵至第110 天，總糖濃度相比最低點（第50 天）上升了8.07%，這可能是因為隨著微生物的大量繁殖和代謝，發(fā)酵液中的總糖濃度下降，使得微生物通過分解作用利用草莓原料中的糖類物質，促進更多的糖類物質溶于發(fā)酵液中。張靜雯等[15]對蘋果酵素發(fā)酵過程中總糖含量進行追蹤發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵前15 d總糖含量下降明顯，微生物迅速擴增，大量消耗糖類物質，之后總糖含量緩慢回升，微生物分解蘋果，部分含糖代謝產物生成，使得酵素總糖含量升高?？偺呛康淖兓c微生物生長繁殖和代謝作用有極大關系，這與本研究中觀察的現(xiàn)象一致。

圖1 總糖含量標準曲線Fig.1 The standard curve of total sugar

圖2 草莓酵素發(fā)酵過程中的總糖消耗量Fig.2 The consumption of total sugar in strawberry jiaosu fermentation

2.2 發(fā)酵過程中總酸含量與pH 值的變化

pH 值可以反映發(fā)酵過程的異常情況，總酸同樣表明發(fā)酵過程中微生物的代謝變化情況。草莓原料中有機酸的主要組成為檸檬酸[16]。本文采用檸檬酸為對照，得到草莓酵素各發(fā)酵時間點的總酸含量的變化趨勢（圖3）。在草莓酵素發(fā)酵前20 d，發(fā)酵液中的總酸含量較低，維持在（15.54 ±1.25）mg/mL，呈緩慢增加的趨勢，此時微量酸類物質產生可能是因微生物尚未快速生長代謝，由草莓原料汁液中有機酸滲出所致。當發(fā)酵20～30 d時，總酸含量顯著增長，這主要是由于酵母菌等微生物大量繁殖，產生大量的次生代謝產物（如乳酸和醋酸等有機酸）所致。相應地，pH 值迅速下降，這與圖1中總糖含量顯著降低的趨勢相一致。發(fā)酵第75 天，總酸含量不斷累積至78.98 mg/mL，隨后總酸含量輕微下降，可能是因為較低的pH 值會較大程度地影響益生菌的繁殖以及代謝，進而降低了醋酸等有機酸的積累；在發(fā)酵后期，乳酸菌等益生菌旺盛的繁殖、代謝，乳酸發(fā)酵占據(jù)主導地位，多元酸的持續(xù)降解導致總酸含量略有下調。萬春美等[17]以茶糖水為碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基，加入紅茶菌發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵過程中加入糖越多，細菌繁殖速度越快，菌落總數(shù)迅速達到最大值，然而維持時間較短。發(fā)酵30 d 后，發(fā)酵液中總糖含量顯著下降造成微生物增殖速度變緩，有機酸亦可能被某些益生菌作為替代碳源被部分消耗，這也是導致總酸含量降低的另一原因。

圖3 草莓酵素不同發(fā)酵時間總酸、pH 的變化Fig.3 Changes in pH value，total titratable acidity during strawberry jiaosu fermentation

2.3 發(fā)酵過程中特征有機酸含量的變化

食用植物酵素制備過程中最常見的3 種菌種主要是酵母菌、醋酸菌和乳酸菌[18]。對食用植物酵素發(fā)酵過程中醋酸和乳酸等含量的變化研究有助于了解發(fā)酵狀態(tài)和發(fā)酵階段。草莓果實中含量最高的兩種有機酸是檸檬酸和L-蘋果酸[16]。本文主要以檸檬酸、L-蘋果酸、醋酸和乳酸為研究對象，考察草莓酵素于其發(fā)酵過程中4 種有機酸含量的變化情況。計算并繪制上述4 種有機酸的標準曲線如表1所示。可見4 種有機酸的標準曲線呈現(xiàn)良好的線性回歸擬合度，R2均高于0.99。

測定不同發(fā)酵時間草莓酵素發(fā)酵液中4 種有機酸含量，由圖4可知，整個發(fā)酵過程中，總酸含量與4 種有機酸含量的增長趨勢相同，發(fā)酵110 d 后4 種有機酸總含量輕微降低。發(fā)酵前20 d，發(fā)酵液中未檢測到醋酸和乳酸，檸檬酸和L-蘋果酸含量僅緩慢上升，總糖含量明顯下降，總酸度顯著降低，這說明在發(fā)酵前期主要是酵母菌利用糖類物質生成丙酮酸、乙醇等代謝產物。發(fā)酵30 d 后，醋酸和乳酸含量快速增長，說明30 d 后醋酸菌開始利用酵母菌產生的乙醇合成醋酸，乳酸菌利用原料中溶出的L-蘋果酸合成乳酸，導致L-蘋果酸含量停止上升并維持在一個較為穩(wěn)定的水平，而乳酸積累量有所增加。發(fā)酵后期L-蘋果酸的積累量緩慢降低，可能是經由蘋-乳代謝路徑，乳酸菌將蘋果酸轉化為乳酸產物。

表1 有機酸標準曲線Table1 Standard curves of organic acids

2.4 草莓酵素發(fā)酵過程中總酚含量的變化

草莓中酚類含量與其抗氧化活性有著密切的關系[19]。從圖5可以發(fā)現(xiàn)，在整個發(fā)酵過程中，總酚含量呈先明顯增加后有所降低的變化趨勢。發(fā)酵至第50 天，總酚積累量達到最高值，為1.67 mg/mL。50 d 內，特別是發(fā)酵20～30 d，總酚含量極速上升，一方面，可能是這個時間段草莓在高滲透壓作用下多酚類物質大量溶出；另一方面，可能是此時草莓酵素中微生物的生長代謝較為迅速，消耗原料中的某些成分進而合成多酚類化合物或者酚類物質的相互轉化所致。Dordevic等[20]以覆盆子為原料，在未添加酵母、15 ℃發(fā)酵72 h 后，總酚含量由初始的1 415.7 mg GAE/L，增到2 191 mg GAE/L；在22 ℃同條件發(fā)酵時，總酚含量達2 820 mg GAE/L。30～50 d，微生物作用下草莓酵素發(fā)酵液中多酚含量進一步提高。延長發(fā)酵時間后，微生物繼續(xù)消耗糖分，液相中生成的酚類物質和原料中溶出的酚類含量趨于平衡。此外，總酚含量上升，對微生物的生長起到一定的抑制作用[21]。部分生存能力強的微生物逐漸適應總酚濃度較高的發(fā)酵液，并利用酚類物質合成其它次級代謝產物，從而導致總酚類物質含量稍微下降。

2.5 草莓酵素發(fā)酵過程中抗氧化指標評價

2.5.1 DPPH 自由基清除能力變化 隨著發(fā)酵過程的進行，草莓酵素對DPPH 自由基清除率指標的影響如圖6所示。發(fā)酵前75 d，草莓酵素對DPPH 自由基的清除率呈現(xiàn)顯著增加的趨勢。草莓酵素發(fā)酵75 d 時，其清除率達最高值80.96%。發(fā)酵前50 d，對DPPH 自由基的清除率呈顯著上升趨勢，50 d 后趨于平穩(wěn)，有小幅下降，這可能與微生物對總酚的降解作用有直接的關系。相比較于發(fā)酵10 d，發(fā)酵至110 d 清除率提高了861.91%，說明較長的時間發(fā)酵有利于大幅提升草莓酵素清除DPPH 自由基的能力。此外，草莓酵素發(fā)酵過程中，發(fā)酵液對DPPH 自由基清除率與發(fā)酵液中總酚含量具有相似的變化趨勢，表明清除DPPH 自由基的能力與酚酸類化合物之間有一定的相關性。在發(fā)酵第0～75 d，草莓酵素對DPPH 自由基的清除能力持續(xù)提高，之后總酚含量略微下降，其DPPH 自由基清除率亦隨之略有下降。綜上可知，草莓酵素中的酚類物質對DPPH 清除能力有一定的貢獻。

圖4 發(fā)酵過程中4 種有機酸變化圖Fig.4 Changes of four organic acids in the fermentation process

圖5 草莓酵素發(fā)酵過程中總酚含量的變化Fig.5 Changes of total phenolic content in the fermentation of Strawberry Jiaosu

2.5.2 羥基自由基清除能力的變化 羥基自由基是人體內常見的自由基之一，可以破壞紅細胞，對DNA、細胞膜等結構造成危害[22]。不同發(fā)酵階段的草莓酵素清除羥基自由基清除率的變化情況如圖7所示。隨著發(fā)酵的進行，導致草莓酵素清除羥基自由基的能力明顯增強，50 d 時清除率達到最高值76.44%，而在發(fā)酵前20 d 呈現(xiàn)促氧化現(xiàn)象，草莓酵素發(fā)酵液中可能含有某些促羥基自由基氧化的物質，第20 天，促氧化與抗氧化作用基本達到平衡。發(fā)酵20 d 后抗氧化效果上升顯著，50～75 d清除率趨于穩(wěn)定，發(fā)酵75 d 后清除率略微下降，這可能與微生物的衰亡有關。Jayabalan R[23]研究發(fā)現(xiàn)，在紅茶菌發(fā)酵過程中，細菌和酵母代謝產生的部分酶，極可能引起茶中成分的結構修飾，使其對氮氧化物和超氧化物自由基兩者的清除能力得到增強，而對于羥基自由基，清除效果表現(xiàn)不佳。由此可見，對羥基自由基清除的能力因原料種類而異。目前關于草莓發(fā)酵過程中代謝產物以及清除羥基自由基的能力報道很少。郭玉華等[24]發(fā)現(xiàn)草莓本身對羥基自由基具有清除能力，推測發(fā)酵前期的促氧化作用很可能與原料表面帶入的細菌、酵母等產生的酶有關。

圖6 草莓酵素對DPPH 自由基的清除率Fig.6 The DPPH free radical scavenging ability of strawberry jiaosu

圖7 草莓酵素對羥基自由基的清除率Fig.7 The hydroxyl free radical scavenging ability of strawberry jiaosu

2.5.3 ABTS 自由基清除能力的變化 除DPPH自由基外，ABTS 自由基同樣可用于評估體外抗氧化活性，在生物制品抗氧化活性的判定中具有較好的應用。Floegel 等[25]通過對比DPPH、ABTS 自由基檢測50 種果蔬的抗氧化能力發(fā)現(xiàn)，利用ABTS 自由基清除率表征的抗氧化指標更能顯著體現(xiàn)果蔬的抗氧化水平。通常情況下，對于高富含植物色素，疏水性強的抗氧化劑，通過ABTS 測定比DPPH 方法能更好地反映各種樣品中的抗氧化能力。草莓酵素對于ABTS 自由基清除率的時間-效應曲線見圖8。當樣品取樣量為150 μL 時，隨著發(fā)酵時間的延長，樣品對ABTS 自由基的清除率持續(xù)上升，在發(fā)酵20～30 d 之間上升顯著，發(fā)酵至50 d 時對ABTS 自由基的清除率高達98.39%，然后趨于穩(wěn)定。由于發(fā)酵時間再次延長，草莓酵素的ABTS 自由基清除率逐漸上升甚至接近100%。蔣增良等[9]研究發(fā)現(xiàn)，葡萄酵素天然發(fā)酵過程中總酚的積累量與其抗氧化指標（ABTS 自由基清除率）之間有明顯的相關性，因此推斷草莓酵素所具有的良好的清除ABTS 自由基的能力可能與酚酸類物質的含量密切相關。

2.5.4 還原力的變化 還原力亦為評估體外抗氧化活性的另一重要方法。在一定范圍內，還原力越大，抗氧化活性越好。圖9顯示不同發(fā)酵時間草莓酵素的還原力的變化。

圖8 草莓酵素對ABTS 自由基的清除率Fig.8 The ABTS free radical scavenging ability of strawberry jiaosu

圖9 發(fā)酵過程中還原力的變化Fig.9 Changes in reducing power during fermentation

如圖9所示，在發(fā)酵的前30 d，還原力上升較為明顯，30 d 后保持緩慢上升。整個發(fā)酵過程中，還原力的增長呈現(xiàn)“先快后慢”的變化趨勢，這與上述3 種抗氧化指標的變化趨勢均有一定相似之處。在取樣量為75 μL，發(fā)酵110 d 時還原力達到0.78。然而，在整個發(fā)酵過程中，還原力與其余3種抗氧化指標仍存有一定的差別。還原力是一個綜合性抗氧化評價指標，與多種抗氧化機制有關，包括過多金屬離子型的催化劑、已結合自由基的清除、過氧化物的分解反應等[26]。

2.6 主成分分析

草莓酵素發(fā)酵過程中，發(fā)酵液中各種代謝產物，如總酸、總酚、醋酸、總糖、檸檬酸、L-蘋果酸、乳酸等含量，可能與各抗氧化指標性能有內在聯(lián)系，然而各種活性物成分含量與各抗氧化指標變化趨勢并不完全一致。為了綜合考慮各組分和指標對不同發(fā)酵時間草莓酵素品質和功效的影響，采用主成分分析法建立草莓酵素的綜合評價指標。

首先，對發(fā)酵過程中各成分與抗氧化指標進行相關性分析。發(fā)酵過程中各參數(shù)相關性見表2。草莓酵素的4 種抗氧化指標之間具有顯著的正相關性（P＜0.01），且與總酚和總酸的積累量之間也有顯著的正相關性（P＜0.01），說明草莓酵素中所含酚酸類物質和有機酸等均有一定的抗氧化功能。其中檸檬酸和L-蘋果酸與抗氧化評價指標之間存在極顯著的相關性（P＜0.01）?？偺呛蚿H 值與其它參數(shù)均呈現(xiàn)負相關，這可能是因為發(fā)酵過程中益生菌消耗糖類物質，代謝積累酸類物質等有關。

表2 發(fā)酵過程中各參數(shù)相關性Table2 Correlation of parameters during fermentation

草莓酵素發(fā)酵過程代謝產物種類多，而且比較復雜。為了更加清晰地揭示各代謝產物與各抗氧化指標之間聯(lián)系，采用主成分分析法（PCA）對上述相關指標進行分析。以特征值為依據(jù)，依次提取第1 主成分及第2 主成分（兩者貢獻率分別達到94.98%和3.31%）。主成分分析所得載荷圖如圖10所示，各指標間的距離很好地反映了彼此的相關性程度?？偺桥cpH 在第1 和第2 主成分中均為負值，相距較近。其它檢測參數(shù)則位于載荷圖中的第1 象限，各指標的第1 和第2 主成分系數(shù)均數(shù)值較大，且彼此間相距不遠，從而表明這10 個參數(shù)均存在顯著的相關性，驗證了之前的相關性分析結果。

發(fā)酵過程中草莓酵素的主成分樣品得分圖見圖11。發(fā)酵第10 天和第20 天第1 主成分與第30，50，75，110 天位置相聚較遠，說明它們之間的性質差別較大，發(fā)酵10 d 與50 d，發(fā)酵20 d 和30 d，第2 主成分相差不大，說明兩者間的主要差別在第1 主成分。發(fā)酵75 d 后第1 主成分與前50 d無顯著差異，不過第2 主成分得分明顯提高。依據(jù)各發(fā)酵時間的主成分得分不同，將不同發(fā)酵時間的草莓酵素樣品分為3 個階段。以主成分分析法為基礎，建立草莓酵素的綜合評價指數(shù)體系（Comprehensive evaluation index，CEI）。按照公式（1）計算，求得CEI 值。

圖10 主成分分析的載荷圖Fig.10 Loading diagram of principal component analysis

圖11 主成分樣品得分圖Fig.11 Main component sample score chart

不同發(fā)酵時間的草莓酵素樣品的綜合評價指標見圖12。發(fā)酵第10 天CEI 值最低，發(fā)酵20～30 d 綜合評價值顯著提高，發(fā)酵30 d 后CEI 值趨于穩(wěn)定，發(fā)酵第75 天CEI 值最高，發(fā)酵至110 d CEI值輕微下降，此作為草莓酵素前發(fā)酵結束的依據(jù)，為后續(xù)流加碳源、接種菌液的時間點判斷提供可靠的理論支撐。

3 結論

通過分析草莓酵素發(fā)酵過程中總糖、總酸、pH、4 種有機酸、總酚含量以及4 種抗氧化指標，結果表明，草莓酵素發(fā)酵過程主要可分為3 個階段，分別是發(fā)酵初期（20 d 前）、發(fā)酵中期（20～30 d）、發(fā)酵后期（30～75 d）。發(fā)酵初期，糖類物質消耗不大，總酸未明顯增強，這個階段基本不含乳酸和醋酸，清除DPPH 自由基、羥基自由基和ABTS 自由基的能力均無明顯變化，可知在此階段主要是微生物菌群的適應期，僅有部分酵母菌代謝作用。發(fā)酵中期總糖含量迅速下降，總酸濃度上升，有機酸物質開始大量產生，乳酸菌和醋酸菌分別開始利用L-蘋果酸和酵母產生的乙醇等物質合成乳酸和醋酸，草莓酵素中的總酚含量呈急劇增長的趨勢，相應地，顯著提升了抗氧化活性。發(fā)酵后期，總糖、總酚和檸檬酸、L-蘋果酸、醋酸、乳酸含量趨于穩(wěn)定，總糖的緩慢上升與酚類含量的輕微下降均是微生物消亡和適應的結果。采用主成分分析法對草莓酵素的各變量進行綜合評價，發(fā)現(xiàn)草莓酵素的CEI 值在發(fā)酵30 d 變化較為穩(wěn)定，發(fā)酵第75 天綜合得分最高，可作為草莓酵素前發(fā)酵結束的依據(jù)，為后續(xù)流加碳源、接種菌液的時間點判斷提供理論支持。

圖12 草莓酵素綜合評價指標Fig.12 Comprehensive evaluation index of strawberry jiaosu