蘇 瓊 文 芳 熊桂斌 熊 欣 黃 露

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院藥劑科 武漢 430077)

檸檬酸是一種重要的有機(jī)酸，又名枸櫞酸，無(wú)色晶體，常含一分子結(jié)晶水，無(wú)臭，有很強(qiáng)的酸味，易溶于水。檸檬酸是生理學(xué)中將脂肪、蛋白質(zhì)和糖轉(zhuǎn)化為二氧化碳的過(guò)程中的重要化合物。這些化學(xué)反應(yīng)是幾乎所有代謝的核心反應(yīng)，并且為高等生物提供能量。檸檬酸是有機(jī)酸中第一大酸，由于物理性能、化學(xué)性能和衍生物的性能，是廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、日化等行業(yè)最重要的有機(jī)酸[1～2]。

檸檬酸在檸檬酸裂解酶的作用下,生成α-酮酸(草酰乙酸),在弱酸條件下,α-酮酸與苯肼生成相應(yīng)的α-酮酸苯腙,α-酮酸苯腙在330nm處有強(qiáng)的吸收峰,吸光度的變化程度可反映出檸檬酸含量[3～4]。通過(guò)檸檬酸裂解酶-苯肼顯色的方法，建立了尿液中枸櫞酸的測(cè)定方法。

1 儀器與試劑

儀器：UV-2450紫外分光光度儀(日本SHIMADZU公司)，PHS-3B精密pH計(jì)(上海精科雷磁)。

試劑：檸檬酸對(duì)照品(優(yōu)級(jí)純，純度：99.8%, 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；檸檬酸裂解酶(Citrate Lyase from Enterobacter aerogene，美國(guó)SIGMA公司)；疊氮鈉(分析純，武漢凱博實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)，硫酸鋅(分析純,天津市博迪化工有限公司)，苯肼(分析純，上海三愛(ài)思試劑有限公司)，Bis-Tris緩沖液(Amresco公司，純度>98%)；試驗(yàn)用水為雙蒸水(自制)。

2 方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和內(nèi)標(biāo)液的配制

苯肼液(246mmol/L)：使用前取50μl苯肼母液置于離心管內(nèi)，加2.0ml蒸餾水混勻配制而成。每次使用前新鮮配制。

檸檬酸裂解酶溶液(13.3ku/L)：取活力為0.3u/mg的檸檬酸裂解酶44.44mg，溶于1ml蒸餾水中，于冰箱(0～4℃)保存?zhèn)溆谩Ｎ词褂猛甑牧呀饷赣?20℃冰箱保存保持活力。

Bis-Tris(50mmol/L)緩沖液：含0.1mmol/L的硫酸鋅和0.2mmol/L疊氮鈉,用12mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH至6.5，于冰箱(0～4℃)保存?zhèn)溆谩?/p>

檸檬酸母液(40 mmol/L)的配制： 精密稱取檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)品0.4202g，定容至50ml，配制成濃度為40 mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)液，于冰箱(0～4℃)保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 樣品處理

20μl苯肼液(246mmol/L)置于EP管內(nèi)，再加入20μl經(jīng)0.22μm濾膜濾過(guò)的尿液或標(biāo)準(zhǔn)液或蒸餾水，渦旋混勻，平行配制兩份，靜置15min，加入1.0mlBis-Tris緩沖液，渦旋混勻，排氣泡，一份在330nm處測(cè)定吸光度Awater，另一份加入20ul檸檬酸裂解酶溶液(13.3ku/L)，靜置30min，測(cè)定吸光度Asample。ΔA=Asample-Awater，尿液中枸櫞酸濃度按以下公式計(jì)算：Csample=(ΔAsample-ΔAwater)/(ΔAstd-ΔAwater)* Cstd。

3 方法學(xué)論證

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

精密稱取檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)品0.4202g，定容至50ml，配制成濃度為40 mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)液，依次稀釋成濃度為20，10，6，4，2，1 mmol/L的標(biāo)液，取各濃度標(biāo)液適量，空白尿液定容，配制成使加入濃度分別為4，2，1，0.6，0.4，0.2，0.1 mmol/L的尿樣標(biāo)準(zhǔn)液，按樣品處理方法進(jìn)行測(cè)定，以所得吸光度的差值 (△A尿標(biāo)-△A尿空)對(duì)濃度(C, mmol/L)進(jìn)行線性回歸(權(quán)重為1)，得枸櫞酸尿藥標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.2154X+0.0066，相關(guān)系數(shù)R2為0.9953，制備方法學(xué)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3.2 最低檢測(cè)限(0.1mmol/L)精密度檢測(cè)

取1 mmol/L濃度標(biāo)液，空白尿液定容，配制成使加入濃度為0.1mmol/L尿樣標(biāo)液，按樣品處理方法進(jìn)行測(cè)定，平行處理5份，測(cè)定其吸光度，計(jì)算枸櫞酸根離子濃度，測(cè)定結(jié)果批內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)差(RSD)為8.42%。

3.3 精密度試驗(yàn)

取2，6，20 mmol/L濃度標(biāo)液，空白尿液定容，配制成使加入枸櫞酸濃度為0.2，0.6，2mmol/L的尿樣標(biāo)液，每個(gè)濃度按樣品處理方法平行處理5份，測(cè)定吸光度，連續(xù)測(cè)定3d，以此計(jì)算日內(nèi)和日間變異，結(jié)果枸櫞酸離子低，中，高濃度日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差(RSD)為4.04%、5.89%、4.93%，日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差(RSD)為6.44%、5.33%、3.46%(表1)。

表1 酶裂解-苯肼顯色法測(cè)定尿中枸櫞酸日內(nèi)日間精密度(n=5)

3.4 相對(duì)回收率試驗(yàn)

取2，6，20 mmol/L濃度標(biāo)液，空白尿液定容，配制成使加入枸櫞酸濃度為0.2，0.6，2mmol/L的尿樣標(biāo)液，每個(gè)濃度按樣品處理方法平行處理5份，測(cè)定吸光度，計(jì)算其枸櫞酸根離子濃度，與理論的枸櫞酸離子濃度相比，計(jì)算相對(duì)回收率。枸櫞酸離子低、中、高3種濃度的平均相對(duì)回收率分別為103.40%、103.44%、98.78%。

3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

3.5.1放置穩(wěn)定性

取0.2，0.6，2mmol/L低，中，高3個(gè)濃度尿樣標(biāo)液，分別于室溫(25℃)下放置0h，2h，4h后，按尿液樣品處理方法進(jìn)行測(cè)定吸光度，計(jì)算其枸櫞酸離子濃度，考察尿液樣品在室溫下不同時(shí)間條件下的穩(wěn)定性，各濃度穩(wěn)定性考察的RSD均小于7.0%(表2)。

3.5.2凍融穩(wěn)定性

將0.2，0.6，2mmol/L低，中，高3個(gè)濃度尿樣標(biāo)液放入-70℃冰凍后取出解凍，分別于凍融前，凍融1次，凍融2次按尿液樣品處理方法進(jìn)行測(cè)定吸光度，計(jì)算其枸櫞酸離子濃度，考察尿液樣品反復(fù)凍融2次的穩(wěn)定性，各濃度穩(wěn)定性考察的RSD均小于7.0%(表2)。

3.5.3長(zhǎng)期穩(wěn)定性

取0.2，0.6，2mmol/L低，中，高3個(gè)濃度尿樣標(biāo)液，于-70℃冰箱保存，分別于配制當(dāng)天、1周、2周和4周后取出，按尿液樣品處理方法進(jìn)行測(cè)定吸光度，計(jì)算其枸櫞酸離子濃度，以考察尿液樣品長(zhǎng)期冷凍穩(wěn)定性，各濃度穩(wěn)定性考察的RSD均小于6.0%(表2)。

結(jié)果表明：低、中、高3個(gè)濃度的尿樣在室溫下放置4h內(nèi)、凍融2次、-70℃條件下貯存4周內(nèi)考察枸櫞酸離子RSD均<7%，表明尿樣在室溫下4h內(nèi)測(cè)定穩(wěn)定，凍融3次測(cè)定穩(wěn)定和-70℃條件下貯存4周內(nèi)測(cè)定穩(wěn)定。

表2 枸櫞酸穩(wěn)定性

4 方法學(xué)試驗(yàn)小結(jié)

通過(guò)檸檬酸裂解酶-苯肼顯色的方法，建立了尿液中枸櫞酸的測(cè)定方法，方法學(xué)試驗(yàn)結(jié)果表明本檢測(cè)方法線性關(guān)系良好；精密度及準(zhǔn)確度試驗(yàn)均符合要求，尿中枸櫞酸低、中、高3種濃度的批間和批內(nèi)變異均小于7.0%；穩(wěn)定性試驗(yàn)表明枸櫞酸在尿液中穩(wěn)定性良好。方法學(xué)試驗(yàn)表明，本試驗(yàn)建立的檸檬酸裂解酶-苯肼顯色測(cè)定法檢測(cè)尿液中枸櫞酸含量符合生物樣品檢測(cè)要求。與其他分析方法比較[3～9]，該方法回收率高，方法穩(wěn)定經(jīng)濟(jì)，操作簡(jiǎn)便。本法可適用于枸櫞酸大樣本尿藥濃度測(cè)定。