穆亞男，杜小明，熊世雙，張德瑞，蔣金芳，李 軍，曹玉文 (.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理系，石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科，新疆 石河子 8000；.皖北煤電集團(tuán)總醫(yī)院腫瘤一科，安徽 宿州 4000；.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院超聲科，新疆 石河子 8000)

乳腺癌變進(jìn)展通常是從普通型導(dǎo)管增生(usual ductal hyperplasia，UDH)、導(dǎo)管原位癌(ductal carcinoma in situ，DCIS)到浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌(infiltrating ductal carcinoma，IDC)的過(guò)程。筆者前期研究及文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，鋅指轉(zhuǎn)錄因子Snail與乳腺癌發(fā)生有著密切關(guān)系。Snail下游存在眾多的調(diào)控因子，其中VDR(Vitamin D receptor，維生素D受體)是一個(gè)重要的Snail下游調(diào)控因子。結(jié)直腸癌中Snail特異性結(jié)合VDR啟動(dòng)子區(qū)域E-box序列，抑制VDR轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[1-2]。骨軟骨瘤細(xì)胞中沉默Snail表達(dá)，提高了VDR表達(dá)，增強(qiáng)VD3抗增殖和促凋亡能力[3-4]。乳腺癌細(xì)胞中，VDR過(guò)表達(dá)導(dǎo)致Snail下調(diào)[5-6]。因此，筆者在乳腺癌變過(guò)程組織中，檢測(cè)Snail和VDR蛋白差異性表達(dá)，分析與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系及在預(yù)后中的價(jià)值，為乳腺癌診斷治療提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料：收集我院病理科2005年6月～2015年8月間石蠟包埋乳腺組織共591例，均為女性，年齡31～80歲，其中IDC 318例， DCIS 61例，UDH 73例，ANBT(距乳腺癌組織至少5 cm以上)139例。所有患者均無(wú)術(shù)前治療，所有病理切片均由多名診斷醫(yī)生復(fù)診。同時(shí)收集乳腺癌患者臨床病理參數(shù)，包括年紀(jì)、組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、原發(fā)腫瘤、淋巴結(jié)及遠(yuǎn)行轉(zhuǎn)移分期和ER、PR、HER-2表達(dá)情況等。所有患者均已簽署知情同意書(shū)，且本研究已獲得我院倫理委員會(huì)審批。

1.2方法

1.2.1免疫組化EnVision法檢測(cè)VDR和Snail在乳腺癌變過(guò)程組織中蛋白表達(dá)。石蠟包埋的乳腺組織，連續(xù)切片后烘烤，依次過(guò)二甲苯脫蠟、酒精水化，高壓抗原修復(fù)后雙氧水封閉，PBS沖洗，分別加一抗(VDR抗體，Santa Cruze，1∶200； Snail抗體，Abcam，1∶50)4℃孵育過(guò)夜，二抗(山羊抗兔/鼠)室溫孵育，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，分化脫水后樹(shù)膠封片。染色結(jié)果由兩位病理醫(yī)師采用雙盲法判讀。VDR蛋白定位在乳腺上皮細(xì)胞膜或漿，陽(yáng)性細(xì)胞的百分比﹤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分。著色強(qiáng)度無(wú)著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。評(píng)定結(jié)果陽(yáng)性細(xì)胞×著色強(qiáng)度分為0～12分，其中0～4分為低表達(dá)，5～12分為高表達(dá)。Snail蛋白定位于細(xì)胞核，陽(yáng)性細(xì)胞百分比≤10%為低表達(dá)，大于10%為高表達(dá)。

1.2.2GEPIA(Gene Expression Profilling Interactive Analysis，http://gepia.cancer-pku.cn/)數(shù)據(jù)庫(kù)能夠根據(jù)不同癌癥類型或病理分期分析基因在腫瘤/正常中差異表達(dá)、患者生存分析、基因相關(guān)性分析和降維分析[7]。筆者使用 GEPIA 來(lái)驗(yàn)證 VDR與Snail表達(dá)相關(guān)性；P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2.3Bc-GenExMiner(Breast Cancer Gene-Expression Miner version 4.1, http:// bcgenex.centregauducheau.fr)工具用于分析基因組數(shù)據(jù)集表達(dá)、預(yù)后和相關(guān)性[8]。筆者評(píng)估了VDR，Snail分別與乳腺癌患者ER、PR、Her2、SBR分級(jí)等臨床病理參數(shù)間的相關(guān)性；P<0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2.4Kaplan-Meier plotter(http:// kmplot.com/analysis/)能夠評(píng)估基因表達(dá)對(duì)不同腫瘤類型存活率的影響[9]。它用于檢測(cè)VDR和Snail mRNA轉(zhuǎn)錄水平的預(yù)后價(jià)值。設(shè)置條件如下：cancer: Breast cancer; gene : VDR/Snail; survival : Overall survival (OS)。對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)用于分析Kaplan-Meier生存曲線。計(jì)算出具有95%置信區(qū)間(CI)的危險(xiǎn)比(HR)；P<0.05被認(rèn)為指示統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。兩組間表達(dá)差異比較采用t檢驗(yàn)。相關(guān)性采用Spearman相關(guān)性分析法和χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1乳腺癌變組織VDR和Snail蛋白差異性表達(dá):VDR蛋白定位于上皮細(xì)胞膜和漿，Snail蛋白表達(dá)于細(xì)胞核。 VDR從ANBT、UDH、DCIS和IDC組中著色強(qiáng)度由棕褐逐漸變?yōu)闇\黃色，其表達(dá)逐漸下降；Snail著色強(qiáng)度由淺黃逐漸變?yōu)樽睾稚?，其表達(dá)逐漸升高。

VDR在四組乳腺組織間表達(dá)兩兩比較有顯著差異，除外UDH與DCIS、DCIS與IDC兩組。Snail在ANBT與IDC組中的表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖1。

2.2乳腺癌變組織VDR和Snail表達(dá)相關(guān)性:VDR和Snail蛋白在各組乳腺組織中表達(dá)的相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)VDR和Snail蛋白在IDC組織中呈顯著負(fù)相關(guān)趨勢(shì)，見(jiàn)表1。GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)顯示VDR和Snail mRNA表達(dá)明顯負(fù)相關(guān)性，這與筆者的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，見(jiàn)圖2。

2.3乳腺癌VDR和Snail表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系:結(jié)果顯示VDR在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性、Her-2陰性患者中的表達(dá)顯著高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性、HER-2陽(yáng)性者，VDR分子在ER陰性、SBR分級(jí)Ⅰ～Ⅱ患者中表達(dá)高于ER陽(yáng)性及SBR分級(jí)Ⅲ級(jí)者，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。Bc-GenExMiner數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)，VDR在ER陰性、SBR分級(jí)Ⅰ～Ⅱ級(jí)中表達(dá)明顯高于ER陽(yáng)性及SBR分級(jí)Ⅲ級(jí)患者，與筆者實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，見(jiàn)圖3。

乳腺組織中VDR和Snail蛋白表達(dá)，*P<0.05。 a. VDR組間表達(dá)比較；b. Snail組間表達(dá)比較

表1 VDR與Snail蛋白表達(dá)在IDC組織中的相關(guān)性

指標(biāo)VDR-++++++r值P值Snail-0.4080.001-652324+862527++101588+++202121

圖2 VDR與Snail mRNA表達(dá)相關(guān)性

表2 VDR蛋白與臨床病理參數(shù)間的相關(guān)性

項(xiàng)目總例數(shù)VDR low(-/+)例數(shù)%χ2值P值A(chǔ)ge<50942728.71.280.257≥501866635.5SBR分級(jí)Ⅰ～Ⅱ級(jí)1103733.60.020.904Ⅲ級(jí)1705632.9淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移-1262822.212.470.001①+1546542.2TNM分期Ⅰ～Ⅱ期1726437.23.210.073Ⅲ～Ⅳ期1082926.8ER-1354029.61.510.219+1455336.5PR-1384633.30.0020.967+1424733.1Her2-2056129.74.120.043①+753242.7

注：①P<0.05

a. VDR mRNA表達(dá)與ER的關(guān)系；b. VDR mRNA表達(dá)與SBR分級(jí)的關(guān)系

Snail蛋白在乳腺癌無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM Ⅰ～Ⅱ期中表達(dá)顯著低于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性與Ⅲ～Ⅳ期患者，Snail分子在 Her2陰性、SBR分級(jí)Ⅰ～Ⅱ患者表達(dá)低于HER-2陽(yáng)性及SBR分級(jí)Ⅲ級(jí)者，而在ER陰性患者表達(dá)高于ER陽(yáng)性者，均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見(jiàn)表3。數(shù)據(jù)庫(kù)分析與筆者的結(jié)果相同，Snail在HER-2陰性、SBR分級(jí)Ⅰ～Ⅱ級(jí)患者中表達(dá)明顯低于HER-2陽(yáng)性及SBR分級(jí)Ⅲ級(jí)患者，在ER陰性表達(dá)明顯高于ER陽(yáng)性患者，見(jiàn)圖4。

2.4VDR和Snail表達(dá)與乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系:使用線上Kaplan-Meier plotter生存分析工具，對(duì)VDR和Snail表達(dá)與乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系進(jìn)行探索，結(jié)果顯示，VDR低表達(dá)的乳腺癌總體生存時(shí)間(OS)明顯小于VDR高表達(dá)患者，見(jiàn)圖5a。而Snail高表達(dá)患者總體生存時(shí)間也顯著小于Snail低表達(dá)者，見(jiàn)圖5b。

表3 Snail蛋白與臨床病理參數(shù)間的相關(guān)性

項(xiàng)目TotalSnail high(++/+++)例數(shù)%χ2值P值A(chǔ)ge<501187866.12.050.152≥50824656.1SBR分級(jí)Ⅰ～Ⅱ級(jí)1368058.81.820.177Ⅲ級(jí)644468.7LN metastasis-1116054.16.690.010*+896471.9TNM分期Ⅰ～Ⅱ期17110058.56.200.013*Ⅲ～Ⅳ期292482.8ER-1066662.30.0070.935+945861.7PR-1056965.71.290.255+955557.9Her2-543259.30.240.627+1469263.0

a. Snail mRNA表達(dá)與ER關(guān)系；b. Snail mRNA表達(dá)與Her關(guān)系；c. Snail mRNA表達(dá)與SBR分級(jí)關(guān)系

a. VDR mRNA表達(dá)與OS之間關(guān)系；b. Snail mRNA水平與OS之間關(guān)系

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，VDR蛋白在乳腺癌變進(jìn)展過(guò)程即ANBT→UDH→DCIS→IDC中的陽(yáng)性率逐漸降低，提示VDR在乳腺癌變過(guò)程中可能充當(dāng)著抑癌基因角色。文獻(xiàn)顯示，VDR在乳腺組織中表達(dá)呈多樣化，早期研究[10-11]表明VDR在乳腺癌組織中高表達(dá)，隨后學(xué)者發(fā)現(xiàn)[12-13]并驗(yàn)證VD類似物對(duì)乳腺癌的治療作用，之后越來(lái)越多研究[14-16]顯示VDR蛋白和mRNA在乳腺上皮細(xì)胞高表達(dá)可以降低癌變幾率,與筆者的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。本實(shí)驗(yàn)分析了VDR在四組乳腺組織中的表達(dá)，VDR在ANBT中表達(dá)分別顯著高于UDH、DCIS和IDC，并且ANBT明顯高于IDC，雖然DCIS中表達(dá)高于IDC組，但是統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)顯著差異，提示VDR蛋白低表達(dá)可能促使正常乳腺上皮發(fā)生良性增生甚至癌變，在癌癥的早期階段起到抑癌作用，與乳腺癌晚期浸潤(rùn)的相關(guān)性不顯著。VDR蛋白在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性和HER-2陰性乳腺癌中表達(dá)明顯升高，Bc-GenExMiner數(shù)據(jù)庫(kù)顯示VDR在ER陰性、SBR分級(jí)Ⅰ～Ⅱ級(jí)中表達(dá)顯著升高，提示VDR蛋白可能承擔(dān)著減緩乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)示更好乳腺癌分子分型的角色。VDR低表達(dá)的乳腺癌患者總體生存時(shí)間明顯小于VDR高表達(dá)者，這與Lopes的研究[17]結(jié)果相呼應(yīng)，說(shuō)明VDR是乳腺癌預(yù)后的一個(gè)保護(hù)性因素。

結(jié)果顯示，Snail蛋白在乳腺癌變過(guò)程組織中逐漸升高，提示Snail在乳腺癌發(fā)生中充當(dāng)一個(gè)癌基因的角色，與Leong KG研究[18]結(jié)果趨勢(shì)相近。進(jìn)一步比較Snail在四組乳腺組織中表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Snail在IDC組表達(dá)顯著高于ANBT，從ANBT到UDH、DCIS發(fā)展到IDC時(shí)，Snail表達(dá)差異不顯著，說(shuō)明Snail可能促進(jìn)了正常乳腺到浸潤(rùn)性乳腺癌的發(fā)生。同時(shí)，筆者發(fā)現(xiàn)Snail蛋白在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性、TNM分期晚期的患者中表達(dá)明顯升高，數(shù)據(jù)庫(kù)顯示Snail在HER-2陰性、SBR分級(jí)Ⅰ～Ⅱ級(jí)患者中表達(dá)明顯降低，在ER陰性者表達(dá)明顯升高，并且Snail高表達(dá)的患者總體生存時(shí)間更短，說(shuō)明Snail蛋白表達(dá)與乳腺癌分子分型相關(guān)，在乳腺癌發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和晚期進(jìn)展中發(fā)揮促進(jìn)作用，并預(yù)示著患者有更差的預(yù)后。Saad等人發(fā)現(xiàn)Snail蛋白表達(dá)上調(diào)，能夠啟動(dòng)EMT，促進(jìn)了乳腺癌發(fā)生以及增加乳腺癌進(jìn)展的幾率[19]。因此，Snail作為一個(gè)促癌基因可能不僅導(dǎo)致乳腺癌變而且能促進(jìn)乳腺癌浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移進(jìn)而標(biāo)志更差的預(yù)后。

筆者分析VDR和Snail蛋白在乳腺癌變過(guò)程組織中表達(dá)的相關(guān)性，二者在IDC組中表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)，在ANBT和DCIS組也呈負(fù)相關(guān)性，差異不明顯，提示Snail和VDR分子在乳腺癌變和進(jìn)展過(guò)程中起著負(fù)性相關(guān)的協(xié)同促進(jìn)作用。Shehla Pervin等研究[5]VDR mRNA在乳腺癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)導(dǎo)致Snail下調(diào)從而損害細(xì)胞成球能力，并且Larriba MJ等發(fā)現(xiàn)VDR在結(jié)直腸癌中表達(dá)是缺失的，Snail作為EMT發(fā)起的誘導(dǎo)物，抑制VDR基因啟動(dòng)子區(qū)[2]。因此，筆者推測(cè)Snail可能作為乳腺組織中VDR的上游調(diào)控因子，通過(guò)抑制VDR表達(dá)促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展。