陳燕，陳歡，陳周恬，李穎穎，楊丹婷*，沈立亮

(1 寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院, 浙江 寧波 315000；2 寧波大學(xué)附屬人民醫(yī)院, 浙江 寧波 315040)

1 引言

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)在自然界廣泛分布，在水、空氣、正常人的皮膚呼吸道和腸道存在，最早由Gessard于1882年分離[1]，是一種機(jī)會致病者，且能分泌銅綠菌素等有害物質(zhì)。有調(diào)查顯示，桶裝飲用水中銅綠假單胞菌污染非常嚴(yán)重。據(jù)世界衛(wèi)生組織 (WHO) 統(tǒng)計(jì), 人類70%～80%的疾病都來源于不潔凈的飲用水。銅綠假單胞菌也是醫(yī)院內(nèi)主要的病原體，存在于免疫功能低下的慢性患者，尤其是燒傷、囊性纖維化、泌尿道感染、支氣管擴(kuò)張等感染中，導(dǎo)致嚴(yán)重的發(fā)病率和死亡率(40～60%)[2]。銅綠假單胞菌的常規(guī)檢測和鑒定目前主要有鋪板培養(yǎng)法、流式細(xì)胞儀法、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)等方法。其中鋪板培養(yǎng)法是金標(biāo)準(zhǔn)方法，具有很高的靈敏性和選擇性，但它們非常耗時(shí)，通常需要24～48小時(shí)。同時(shí)，抗生素不合理使用造成的細(xì)菌耐藥性導(dǎo)致病人產(chǎn)生嚴(yán)重的并發(fā)癥、治療成本增加和臨床用藥困難等問題。由銅綠假單胞菌污染導(dǎo)致的疾病治療依賴于對細(xì)菌早期、準(zhǔn)確和快速的識別。因此，建立銅綠假單胞菌準(zhǔn)確快速地早期檢測方法是治療感染性疾病的重要前提和必要手段。

銅綠假單胞菌在生長過程中會分泌大量的生物毒素以保證其在宿主內(nèi)的生存[5]。在早期感染中，銅綠菌素(pyocyanin，PYO)是唯一能被銅綠假單胞菌分泌的次級代謝產(chǎn)物，可以作為檢測銅綠假單胞菌的生物標(biāo)志物。它是一種藍(lán)色的、具有氧化還原活性的含N芳香族化合物。銅綠菌素在環(huán)境中可以作為信號分子、毒性因子和微生物的媒介發(fā)揮作用，即使在復(fù)雜環(huán)境基質(zhì)中，低濃度的細(xì)菌代謝產(chǎn)物也可被成功檢測并用以識別被污染的水源或醫(yī)療器械等。臨床上檢測標(biāo)本中PYO的傳統(tǒng)方法是通過氯仿提取然后采用高效液相質(zhì)譜聯(lián)用方法(HPLC-MS)測試，前處理耗時(shí)、昂貴和復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)室程序在很大程度上限制了HPLC作為臨床診斷工具的使用[8]。因此開發(fā)成本低、快速、簡單、靈敏度高、特異性好的PYO即時(shí)檢測平臺，以省去實(shí)驗(yàn)室復(fù)雜處理程序，有助于快速獲得患者的檢查結(jié)果，輔助醫(yī)生進(jìn)行精準(zhǔn)治療，是臨床細(xì)菌檢測迫切的需求。

表面增強(qiáng)拉曼光譜(Surface-enhanced Raman spectroscopy, SERS)技術(shù)是近年來時(shí)興的振動光譜技術(shù)，具備高靈敏度、高分辨率、檢測速度快、免標(biāo)記、可提供生物樣品指紋圖譜的突出優(yōu)勢，滿足病原菌快速檢測需求。自2016年以來，SERS技術(shù)不斷被應(yīng)用在PYO的檢測研究中，例如在金納米顆粒覆蓋的SERS基底上鋪一層瓊脂對銅綠假單胞菌生物膜的信號分子進(jìn)行成像研究，或者結(jié)合微流控技術(shù)實(shí)現(xiàn)對PYO的檢測。但是無論是成像還是實(shí)現(xiàn)微流控均需要額外的設(shè)備及專業(yè)人員進(jìn)行操作，耗時(shí)長，臨床樣本往往需要進(jìn)行氯仿前處理，不適用于即時(shí)檢測的快速、便捷要求。因此，本文開發(fā)了一種低成本的SERS陣列以實(shí)現(xiàn)對復(fù)雜基質(zhì)中PYO的快速即時(shí)檢測。通過靜電吸附的作用將銀納米顆粒穩(wěn)定修飾于硅烷化的玻璃片表面以形成靈敏度高的SERS基底，無需任何預(yù)處理可實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)基和唾液中PYO微摩爾級別的直接快速檢測。

2 實(shí)驗(yàn)

2.1 試劑與儀器

氯金酸(HAuCl4·3H2O，99.9%)、硝酸銀(AgNO3，≥99.0%)、硼氫化鈉(NaBH4，99.99%)、3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES，≥98%)、4-巰基苯甲酸(4-MBA，99%)、銅綠菌素(Pyocyanin)購于Sigma-Aldrich公司；甲醇(CH4O)、無水乙醇(C2H6O)、檸檬酸鈉(Na3C6H5O7，98%)購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；鹽酸(HCl，37%)購于浙江中星化工試劑有限公司；硝酸(HNO3)購于蘭溪市六洞山化工試劑廠； Hellmanex III購于Hellma GmbH；LB肉湯購于杭州微生物試劑有限公司。

氮?dú)赓徲趯幉|錢湖方辛煉氣壓廠；HORIBA XploRA ONE拉曼光譜儀購于上海HORIBA Scientific公司；真空干燥箱、電熱鼓風(fēng)干燥箱購于上海一恒科學(xué)儀器有限公司；紫外可見光分光光度儀購于南京菲勒儀器有限公司；臺式高速冷凍離心機(jī)購于湖南赫西儀器裝備有限公司；超純水(18.25 MΩ·cm-1)取自杭州永潔達(dá)凈化科技有限公司的超純水器。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1金、銀納米顆粒(AuNPs、AgNPs)的合成

AuNPs的合成：采用Frens G[15]發(fā)明的檸檬酸鈉還原氯金酸方法合成。將2.5 mL的10 mM氯金酸溶液加入到97.5 mL的去離子水中在磁力劇烈攪拌的同時(shí)加熱到沸騰，快速加入1.5 mL 1%檸檬酸鈉溶液并繼續(xù)加熱攪拌30 min。反應(yīng)結(jié)束后自然冷卻至室溫。紅色的AuNPs合成后用0.22 μm濾膜過濾后將其密封避光置于4℃的冰箱保存以備用。

AgNPs的合成：采用Lee和Melsel[16]的方法略加改進(jìn)合成而得。將102.9 mg的檸檬酸鈉溶解在45 mL去離子水中，混合均勻，待溶液沸騰后加入5 mL硝酸銀(1 mM)和10 μL 1 mM硼氫化鈉，繼續(xù)加熱并攪拌1 h。反應(yīng)結(jié)束后自然冷卻至室溫。黃綠色的AgNPs合成后用0.22 μm濾膜過濾后將其密封避光置于4 ℃的冰箱保存以備用。

2.2.2銀納米顆粒陣列制備

圖1 銀納米顆粒陣列示意圖Fig.1 Schematic of AgNPs array

本文使用玻璃片作為SERS陣列的修飾基底，原因在于其穩(wěn)定的物理、化學(xué)性質(zhì)，表面具有均一性，鈍化性和有效性，成本低，表面易被修飾。銀納陣列的構(gòu)建步驟如下：1. 清洗：將普通的玻璃載玻片放于裝有2%的Hellmanex溶劑的塑料染色盒中并超聲清洗1 h，繼而用200 mL的去離子水超聲清洗5 min共5次并用氮?dú)獯蹈桑缓?將玻璃片沒入200 mL的甲醇/鹽酸溶液(v∶v=1∶1)中在室溫下震蕩孵育1 h，之后用200 mL去離子水超聲清洗5 min共5次并氮?dú)獯蹈桑旁谡婵崭稍锵鋬?nèi)100 ℃ 烘干1 h。2. 表面修飾氨基：將清洗后的玻片浸入到APTES/乙醇(1% v/v)內(nèi)在60 ℃水浴加熱30 min使其表面覆蓋氨基，結(jié)束后玻片用乙醇超聲清洗5 min共2次，最后放入120 ℃的真空干燥箱內(nèi)烘干1 h。3.表面修飾納米顆粒：干燥后浸入至上述準(zhǔn)備好的AuNPs或AgNPs溶液中孵育2 h，用氮?dú)獯蹈珊髢Υ嬖诙栊詺怏w的干燥箱中備用。

2.2.3納米陣列的表征

AuNPs和AgNPs膠體溶液及其陣列的消光光譜測量：由紫外-可見分光光度計(jì)獲得。取AuNPs或AgNPs膠體溶液于1 mL比色皿中進(jìn)行吸光度的檢測。以空白玻片作為對照，將表面修飾AuNPs或AgNP陣列的玻璃片夾于分光光度計(jì)光路可通過的卡槽內(nèi)進(jìn)行檢測。檢測參數(shù)設(shè)置：掃描波長為300～800 nm，分辨率為2 nm。

玻片陣列的掃描電子顯微鏡圖像獲取和分析：表面修飾有AgNPs的玻片陣列表面形貌由Hitachi SU-70掃描電子顯微鏡獲得。

玻片陣列的拉曼成像表征：玻片陣列的均勻性測試使用Renishaw inVia型顯微共聚焦拉曼光譜儀獲得。在樣品檢測前對拉曼光譜儀利用硅片(Si)在520.1 cm-1峰作為基準(zhǔn)峰進(jìn)行儀器校準(zhǔn)。表面增強(qiáng)拉曼光譜采集激光波長為488 nm，掃描光譜范圍為400～2000 cm-1，分辨率為1 cm-1，成像檢測區(qū)域?yàn)?.5 μm×7.5 μm。10 μL羅丹明6G(1 μM)滴于玻片陣列上進(jìn)行拉曼成像。

2.2.4肉湯培養(yǎng)基及唾液中不同濃度PYO的制備

稱取25 g LB肉湯溶于1000 mL蒸餾水中，121 ℃ 15 min高壓滅菌后，在培養(yǎng)基里加標(biāo)不同濃度的PYO，使其最終濃度為10-5M、2×10-6M、10-6M、2×10-7M、10-7M、5×10-8M。

取1 mL正常人的唾液，在唾液中加標(biāo)不同濃度的PYO，使其最終濃度為5×10-5M、2×10-5M、10-5M、5×10-6M、2×10-6M、10-6M。

2.2.5樣品的拉曼檢測

使用HORIBA XploRA ONE拉曼光譜儀獲得拉曼光譜。在樣品檢測前對拉曼光譜儀利用硅片(Si)在520.1 cm-1峰作為基準(zhǔn)峰進(jìn)行儀器校準(zhǔn)。表面增強(qiáng)拉曼光譜采集激光波長為785 nm，激光強(qiáng)度設(shè)置為50%，功率為120 mW，50×目鏡，曝光時(shí)間為60 s，掃描光譜范圍均為400～2000 cm-1，分辨率為1 cm-1。

AuNPs及AgNPs陣列的比較：移液槍取3 μL 1 mM 4-MBA溶液各滴于表面修飾AuNPs或AgNPs的玻片陣列上，至少選取3個(gè)不同的位置進(jìn)行拉曼光譜采集。

PYO樣品的SERS光譜測量：移液槍取2.5 μL含有PYO的培養(yǎng)基或者唾液樣本分別滴于修飾AgNPs的玻片陣列上，直接進(jìn)行拉曼光譜采集，每個(gè)樣品至少采集3次。

2.2.6數(shù)據(jù)處理

(1)使用NGSLabSpec 5.0軟件對拉曼光譜數(shù)據(jù)的采集和處理，在進(jìn)行拉曼峰強(qiáng)的計(jì)算時(shí)，采用軟件中的三級多項(xiàng)式算法的基線自動校正功能減除背景。

(2)使用Origin 8.0軟件和Adobe Illustrator軟件對數(shù)據(jù)圖和光譜圖進(jìn)行處理。

3 結(jié)果與討論

3.1 AgNPs膠體及表面修飾AgNPs的玻片陣列的光學(xué)表征

紫外-可見分光光度計(jì)用來對合成的AgNPs膠體溶液和修飾AgNPs的玻片陣列進(jìn)行光學(xué)表征。從圖2a可看出AgNPs膠體溶液的消光光譜在420 nm有最大峰值；雖然修飾了AgNPs的玻片陣列的消光光譜圖最強(qiáng)的峰值發(fā)生14 nm的紅移，但其譜圖與AgNPs膠體溶液的譜圖相似，說明AgNPs成功修飾在玻片上。同時(shí)，為獲得最佳覆蓋度的SERS基底陣列，我們對AgNPs膠體溶液在玻片上修飾的時(shí)間進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，修飾時(shí)間為2小時(shí)的玻片陣列消光光譜峰強(qiáng)度最高，被選為樣品檢測的最優(yōu)修飾時(shí)間。

圖2 (a) AgNPs膠體及不同孵育時(shí)間下(1 h，2 h，3 h)的AgNPs玻片陣列(GS)的消光光譜；(b) a. AgNPs陣列在617.28 cm-1拉曼位移下的拉曼成像圖；b. R6G的SERS光譜圖；c. AgNPs玻片陣列的SEM圖像Fig.2 (a) Extinction spectra of AgNPs array at different incubation time with Ag NPs colloidal solution (1h, 2h, 3h) and AgNPs colloidal solution; (b) a. Raman mapping of AgNPs array at 617.28 cm-1 of R6G; b. SERS spectra of R6G; c. SEM of AgNPs array

3.2 修飾AgNPs玻片陣列的拉曼表征

首先我們比較了分別由AgNPs和AuNPs修飾的玻片基底增強(qiáng)效果，從圖3可以看出，AgNPs修飾的玻片基底無論是從出峰的數(shù)量還是強(qiáng)度均優(yōu)于AuNPs修飾的玻片基底。探針分子4-MBA主要被增強(qiáng)的兩個(gè)特征拉曼峰位于1069 cm-1和1577 cm-1處，通過計(jì)算1577 cm-1處的拉曼強(qiáng)度，可知AgNPs修飾玻片基底的增強(qiáng)效果約是AuNPs修飾玻片基底的10倍。同時(shí)，為更好的檢測陣列的均勻度，我們對2 h修飾的AgNPs玻片陣列進(jìn)行了SEM圖像(圖2b(b))及拉曼成像的表征(圖2b(a、c))。從SEM的圖像可看出，AgNPs在玻片上形成了較為均勻的陣列結(jié)構(gòu)，AgNPs的平均顆粒大小約為38 nm，顆粒間的平均間距約為30 nm；通過對1 μM的羅丹明6G 617.28 cm-1處的拉曼峰進(jìn)行7.5 μm×7.5 μm的拉曼成像，也可看出圖2b(a)中黑色數(shù)據(jù)點(diǎn)較為均勻的分布，證明我們的陣列具備較好的數(shù)據(jù)點(diǎn)重復(fù)性。

圖3 4-MBA在AgNPs和AuNPs修飾的玻片陣列上的SERS光譜Fig.3 SERS spectra of 4-MBA (1 μM) on AgNPs array and AuNPs array

3.3 PYO的特征光譜

銅綠菌素是一種藍(lán)色的、具有氧化還原活性的含N芳香族化合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式可見圖4(a)。其在550～800 nm處有一個(gè)寬吸收峰，根據(jù)文獻(xiàn)研究[17]，當(dāng)選擇785 nm的拉曼激光波長時(shí)，銅綠菌素可實(shí)現(xiàn)共振拉曼增強(qiáng)效應(yīng)，獲得高靈敏度的拉曼信號。如圖4(b)所示，PYO的拉曼光譜特征峰分別位于420，530，543，597，680，1354，1598和1615 cm-1等。其中，420 cm-1的峰主要?dú)w屬于環(huán)內(nèi)扭曲，543 cm-1的峰主要?dú)w屬于C-N扭曲，597 cm-1的峰主要?dú)w屬于C-C，C-N和C-H平面外彎曲振動，680 cm-1的峰主要?dú)w屬于環(huán)變形，1354 cm-1的峰主要?dú)w屬于C-C伸縮、C-N伸縮和C-H面內(nèi)彎曲，1598 cm-1和1615 cm-1的峰主要?dú)w屬于環(huán)變形，C-C伸縮振動和面內(nèi)彎曲。在接下來的培養(yǎng)基和唾液PYO的SERS檢測中，我們將選擇各自最強(qiáng)的特征峰作為定量峰，建立各自的定量分析模型。

圖4 (a) PYO的吸光度光譜和結(jié)構(gòu)式；(b) PYO水溶液的SERS光譜(10 μM)Fig.4 (a) Absorbance spectrum and chemical structure of PYO; (b) SERS spectrum of PYO in aqueous solution (10 μM)

3.4 LB培養(yǎng)基中不同濃度PYO的SERS檢測

為測試所構(gòu)建的SERS玻片陣列直接用于復(fù)雜基質(zhì)中PYO的檢測可行性，我們挑選了可培養(yǎng)銅綠假單胞菌的LB培養(yǎng)基作為首選的測試基質(zhì)，在其中加標(biāo)不同濃度的PYO，使其最終濃度為10-5M、2×10-6M、10-6M、2×10-7M、10-7M、和5×10-8M。通過圖5(a)可以看出，隨著PYO濃度的不斷增加，420、543、1354、1598 cm-1處的拉曼信號強(qiáng)度也隨之增強(qiáng)。通過計(jì)算不同拉曼位移下的PYO拉曼強(qiáng)度，以PYO濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，SERS信號強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，可得不同拉曼位移下，PYO濃度和SERS信號強(qiáng)度之間的線性關(guān)系。通過比較四個(gè)拉曼位移下所得的線性相關(guān)系數(shù)可得，當(dāng)拉曼位移為420 cm-1時(shí)，R2為0.959，相關(guān)系數(shù)最大，被選擇為培養(yǎng)基溶液中的定量峰。

圖5 (a) 培養(yǎng)基中不同濃度PYO的SERS 光譜；(b)PYO濃度及拉曼強(qiáng)度建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 (a) SERS spectra of PYO at different concentrations in LB medium; (b) The calibration curve based on PYO concentration vs Raman intensity

采用線性回歸方法，在PYO濃度(5×10-8M～10-5M)范圍與SERS光譜在420 cm-1處的拉曼特征峰的峰強(qiáng)之間建立了線性回歸模型y=15862+9548.9x，檢測限(S/N=3)為0.5 μM。

3.5 唾液中不同濃度PYO的SERS檢測

為驗(yàn)證SERS玻片陣列在臨床應(yīng)用中的可行性，我們在正常人的唾液中加標(biāo)不同濃度的PYO(10-4M、5×10-5M、2×10-5M、10-5M、5×10-6M、和2×10-6M)。圖6(a)為PYO在唾液中不同濃度的SERS光譜。從圖中可以看出，隨著PYO的濃度增高，420、543、1354、1615 cm-1處的拉曼信號強(qiáng)度也隨之增強(qiáng)。通過計(jì)算不同拉曼位移下的PYO拉曼強(qiáng)度，以PYO濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，SERS信號強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，可得不同拉曼位移下，PYO濃度和SERS信號強(qiáng)度之間的線性關(guān)系。不同于LB培養(yǎng)基，唾液中在拉曼位移為1615 cm-1時(shí)，R2為0.9962，線性關(guān)系最大，因此在唾液中選擇1615 cm-1作為定量峰。在PYO濃度(2×10-6M～10-5M)范圍與SERS光譜在1615 cm-1處的拉曼特征峰之間建立了線性回歸模型為y=-125+257.8x，檢測限(S/N=3)為0.35 μM。

圖6 (a) 培養(yǎng)基中不同濃度PYO的SERS 光譜; (b)PYO濃度及拉曼強(qiáng)度建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 (a) SERS spectra of PYO at different concentrations in saliva; (b) The calibration curve based on PYO concentration vs Raman intensity

4 結(jié)論

本文構(gòu)建了一種低成本的、AgNPs修飾的玻片SERS陣列，無需任何前處理可直接實(shí)現(xiàn)在培養(yǎng)基及唾液中對銅綠假單胞菌的分泌物銅綠菌素的定量分析。通過對玻璃片進(jìn)行氨基硅烷化修飾并利用靜電吸附原理在其表面均勻吸附一層銀納米顆粒，可構(gòu)建具有重復(fù)性好、靈敏度高的表面增強(qiáng)拉曼效應(yīng)的可拋棄式陣列，以獲得銅綠菌素的表面增強(qiáng)共振拉曼光譜。此SERS陣列則可以直接獲得銅綠菌素的有效拉曼光譜峰，其主要的特征峰主要為420，543，597，680，1354，1598，和1615 cm-1，其中用來進(jìn)行定量分析的420 cm-1和1615 cm-1處拉曼位移分別歸屬于-CCN環(huán)彎曲和-C-N彎曲，及C=C環(huán)拉伸和C=N環(huán)拉伸。此陣列對肉湯培養(yǎng)基和唾液的PYO檢測限分別為0.5 μM和0.35 μM，遠(yuǎn)低于臨床樣本中檢測銅綠菌素的濃度，表明我們所構(gòu)建的SERS玻片陣列，方法簡單、攜帶方便、可拋棄，具備適用于臨床上銅綠假單胞菌代謝產(chǎn)物銅綠菌素高靈敏的即時(shí)檢測潛力。

5 致謝

感謝浙江省自然科學(xué)基金(LY17H260003)、浙江省病理生理學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放項(xiàng)目、寧波大學(xué)王寬誠基金對本研究的資助。