朱琳，孫玄靜，陳鵬，顧向浩，周云

膝骨性關(guān)節(jié)炎(KOA)是一種常見的中老年女性群體多發(fā)的慢性進(jìn)行性骨關(guān)節(jié)退變性疾病[1]。不同程度的關(guān)節(jié)僵硬、疼痛，局部腫脹、畸形和功能障礙是該病的主要臨床表現(xiàn)，進(jìn)行性關(guān)節(jié)軟骨破壞和退變，軟骨下骨硬化或囊性變，關(guān)節(jié)滑膜增生，關(guān)節(jié)邊緣形成骨贅，關(guān)節(jié)囊攣縮或肥大，以及韌帶攣縮或松弛等是其病理特征[2]。關(guān)于膝骨性關(guān)節(jié)炎的病理機(jī)制尚不十分清楚，目前仍缺乏特異性的治療方法，減輕疼痛，控制疾病進(jìn)展，結(jié)合患者病情決定使用藥物或非藥物治療是當(dāng)前的治療原則。作為一種天然的氨基酸單糖，硫酸氨基葡萄糖能補(bǔ)充軟骨基質(zhì)，使軟骨降解減緩，促進(jìn)軟骨細(xì)胞合成蛋白聚糖，是軟骨的營(yíng)養(yǎng)類藥物[3]。依托考昔是環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)的特異性抑制劑，作為非甾體類抗炎藥，具有止痛、抗炎及退熱的作用[4]。臨床上常將2種藥物聯(lián)合使用治療膝骨性關(guān)節(jié)炎且已取得顯著療效，然而未見硫酸氨基葡萄糖聯(lián)合依托考昔對(duì)關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)的作用機(jī)制報(bào)道，因此本研究旨在探討兩者聯(lián)合用藥對(duì)膝骨性關(guān)節(jié)炎軟骨修復(fù)的作用機(jī)制，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年1月—2019年5月徐州市中醫(yī)院風(fēng)濕免疫科診治膝骨性關(guān)節(jié)炎患者106例作為研究對(duì)象。隨機(jī)分為2組，對(duì)照組40例，男9例，女31例，平均年齡(62.07 ±11.32)歲；平均病程(3.59±0.75)月；發(fā)病部位，左膝18例，右膝22例；Kellgren-Lawrence分級(jí)，Ⅰ級(jí)9例，Ⅱ級(jí)15例，Ⅲ級(jí)16例。觀察組66例，男14例，女52例，平均年齡(61.58±10.24)歲；平均病程(3.74±0.89)月；發(fā)病部位，左膝35例，右膝31例；Kellgren-Lawrence分級(jí)，Ⅰ級(jí)16例，Ⅱ級(jí)27例，Ⅲ級(jí)23例。2組患者一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。 本研究已通過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，患者及家屬均知情同意并簽署同意書。

1.2 選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)診斷標(biāo)準(zhǔn)：均符合美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)制定的標(biāo)準(zhǔn)[5]，①年齡>40 歲；②1個(gè)月內(nèi)大多數(shù)時(shí)間有膝關(guān)節(jié)疼痛癥狀；③晨僵持續(xù)時(shí)間<30 min；④活動(dòng)時(shí)關(guān)節(jié)有摩擦音；⑤關(guān)節(jié)滑液檢查有骨關(guān)節(jié)炎癥狀；⑥X 線片觀察可見關(guān)節(jié)邊緣形成骨贅。(2)納入標(biāo)準(zhǔn)：均符合以上診斷標(biāo)準(zhǔn)且單膝發(fā)??；對(duì)硫酸氨基葡萄糖和依托考昔無過敏史。(3)排除標(biāo)準(zhǔn)：患者合并內(nèi)分泌系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、心、肝、腎及腫瘤等疾?。缓喜⒅w先天畸形、皮膚病、膝關(guān)節(jié)局部急性創(chuàng)傷等疾??；患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、化膿性關(guān)節(jié)炎、創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)、強(qiáng)直性脊椎炎等風(fēng)濕性疾??；近1個(gè)月內(nèi)使用過皮質(zhì)激素類和非甾體抗炎類藥物、免疫調(diào)節(jié)劑，以及其他湯藥、中成藥或接受過理療；患有精神類、意識(shí)功能障礙等疾??；患者病歷資料丟失或不全，中途退出者。

1.3 治療方法 對(duì)照組給予依托考昔[Merck Sharp&Dohme(Australia)Pty.Ltd生產(chǎn)]60 mg/次口服，1次/d。觀察組在對(duì)照組基礎(chǔ)上予硫酸氨基葡糖鉀膠囊(留普安，山西康寶生物制品股份有限公司生產(chǎn)) 0.5 g/次口服，3次/d，2組均連續(xù)治療6周。治療期間囑患者注意保暖，指導(dǎo)其進(jìn)行股四頭肌舒縮功能鍛煉，禁止跑步、下蹲、爬樓梯及爬山等加重膝關(guān)節(jié)負(fù)重的活動(dòng)，若出現(xiàn)任何可能與治療方案有關(guān)的不良反應(yīng)均立即停藥并退出本研究項(xiàng)目。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.4.1 臨床療效評(píng)價(jià)：臨床控制，膝關(guān)節(jié)腫脹、疼痛等臨床癥狀和體征完全消失，關(guān)節(jié)功能恢復(fù)正常；顯效，靜息時(shí)無膝痛，偶爾活動(dòng)時(shí)疼痛，關(guān)節(jié)功能明顯恢復(fù)，對(duì)工作和生活均不產(chǎn)生影響；有效，膝痛有時(shí)發(fā)作，行走時(shí)輕度疼痛，膝關(guān)節(jié)功能基本恢復(fù)，上下樓梯稍感不便；無效，治療后腫脹、疼痛等臨床癥狀未改變，膝關(guān)節(jié)功能無好轉(zhuǎn)?？傆行?(臨床控制+顯效+有效)/總例數(shù)×100%。

1.4.2 膝關(guān)節(jié)功能評(píng)估：治療前后采用西安大略和麥克馬斯特大學(xué)(WOMAC)骨關(guān)節(jié)炎指數(shù)量表評(píng)估，該量表由3部分，共24項(xiàng)組成，每項(xiàng)評(píng)分有5個(gè)等級(jí)，無困難為0分，輕度為1分，中度為2分，重度為3分，極度為4分，滿分96分；其中疼痛情況有5項(xiàng)，滿分20分；關(guān)節(jié)僵硬程度有2項(xiàng)，滿分8分；關(guān)節(jié)功能有17項(xiàng)，滿分68分。得分越高說明患者膝骨性關(guān)節(jié)炎病情越重。

1.4.3 骨代謝指標(biāo)檢測(cè)：分別于治療前和治療后行關(guān)節(jié)腔穿刺抽取關(guān)節(jié)液5～10 ml，其中1～2 ml采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，嚴(yán)格參照試劑盒說明書檢測(cè)骨鈣素(BGP)、骨保護(hù)素(OPG)、Ⅱ型膠C-端肽(CTX-Ⅱ)、軟骨寡聚基質(zhì)蛋白(COMP)、核轉(zhuǎn)錄因子κB受體活化因子配體(RANKL)。人CEACAM1 ELISA試劑盒(BGP)、人Osteoprotegerin ELISA試劑盒、人COMP ELISA試劑盒、人TNFSF11 ELISA試劑盒(RANKL)均為Abcam產(chǎn)品，Cytochrome P450 27A1 (CYP27A1) BioAssay ELISA Kit (Human)為USBiological產(chǎn)品。

1.4.4 生長(zhǎng)因子檢測(cè)：上述關(guān)節(jié)液1～2 ml，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，嚴(yán)格參照試劑盒說明書檢測(cè)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β (TGF-β)、胰島素樣生長(zhǎng)因子1(IGF-1)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2 (FGF-2)。人TGF-β ELISA試劑盒、人IGF-1 ELISA試劑盒、人FGF-2 ELISA試劑盒均為Abcam產(chǎn)品。

1.4.5 炎性因子檢測(cè)：上述關(guān)節(jié)液1～2 ml，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，嚴(yán)格參照試劑盒說明書檢測(cè)白介素1β (IL-1β)、IL-17、IL-18、腫瘤壞死因子α (TNF-α)。人IL-1 β ELISA試劑盒、人IL-17 ELISA試劑盒、人IL-18 ELISA試劑盒、人TNF-α ELISA試劑盒均為Abcam產(chǎn)品。

1.4.6 基質(zhì)金屬蛋白酶檢測(cè)：上述關(guān)節(jié)液1～2 ml，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，嚴(yán)格參照試劑盒說明書檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶3(MMP-3)、MMP-9、MMP-13。Human Total MMP3 ELISA Kit、Human MMP9 ELISA Kit、Human MMP-13 ELISA Kit均為proteintech 公司產(chǎn)品。

1.4.7 NO誘導(dǎo)凋亡的相關(guān)因子檢測(cè)：上述關(guān)節(jié)液1～2 ml，采用相應(yīng)試劑盒，嚴(yán)格參照試劑盒說明書檢測(cè)一氧化氮(NO)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化脂質(zhì)(LPO)。NO測(cè)定試劑盒(酶法)比色法、SOD測(cè)定試劑盒(WST-1 法)、LPO試劑盒均為南京建成公司產(chǎn)品。

1.4.8 JNK和Wnt5a的mRNA檢測(cè)：采用Trizol法提取治療前后關(guān)節(jié)液中總RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以得到的cDNA作為模板，進(jìn)行RT-qPCR，以檢測(cè)C-Jun氨基末端激酶(JNK)和Wnt5a的表達(dá)情況，JNK上游引物序列:5’-CGGGATCTTCAACTTTAACAT GGAAGTGCTTTCTGTGACTTTAAA-3’，下游引物:5’-CCCAAGCTTACTCCTACTAAAAAGCACTTACTTTTAAAGTC-3’；Wnt5a上游引物:5'-CACACACTACATCAGTGGCTCAAAG-3'，下游引物:5'-TCCAGCACATGAACGTGTAAACAG-3'；同時(shí)將GAPDH(上游引物:5’-CTTTAACATGGAAGTGCGGGA-3’，下游引物:5’-CTAAAAAGCACTTACCCCAAGCTATC-3’)作為內(nèi)參基因，每個(gè)樣本均重復(fù)進(jìn)行3次試驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 2組臨床療效比較 治療6周后，觀察組總有效率達(dá)92.43%，高于對(duì)照組的67.5%(χ2=20.770，P=0.000)，見表1。

表1 2組患者臨床療效比較 [例(%)]

2.2 2組治療前后WOMAC量表評(píng)分比較 2組患者治療前各項(xiàng)評(píng)分和WOMAC總分比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)； 2組患者治療6周后各指標(biāo)均降低(P<0.01)，且觀察組均低于對(duì)照組 (P<0.01)，見表2。

表2 2組患者治療前后WOMAC量表評(píng)分比較

2.3 2組治療前后骨代謝指標(biāo)比較 治療前2組患者關(guān)節(jié)液中BGP、OPG、CTX-Ⅱ、COMP及RANKL水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；治療6周后2組BGP和OPG升高，CTX-Ⅱ、COMP及RANKL均降低，且觀察組升高/降低幅度大于對(duì)照組(P<0.01)，見表3。

表3 2組患者治療前后骨代謝指標(biāo)比較

2.4 2組治療前后生長(zhǎng)因子水平比較 治療前2組TGF-β、IGF-1及FGF-2水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；治療6周后2組各指標(biāo)均升高，且觀察組高于對(duì)照組(P<0.01)，見表4。

表4 2組患者治療前后生長(zhǎng)因子水平比較

2.5 2組治療前后炎性因子和基質(zhì)金屬蛋白酶水平比較 治療前，2組炎性因子及基質(zhì)金屬蛋白酶水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；治療6周后2組各指標(biāo)均降低(P<0.01)，且觀察組均低于對(duì)照組 (P<0.01)，見表5、6。

表5 2組患者治療前后炎性因子水平比較

表6 2組患者治療前后基質(zhì)金屬蛋白酶水平比較

2.6 2組治療前后JNK 和Wnt5a的mRNA 水平比較 治療前2組患者JNK 和Wnt5a的mRNA 水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)。治療6周后2組均降低，且觀察組低于對(duì)照組(P<0.05)，見圖1。

注：與治療前比較，aP<0.05；與對(duì)照組相同時(shí)間點(diǎn)比較，bP<0.05

2.7 2組治療前后NO誘導(dǎo)凋亡因子比較 治療前2組患者關(guān)節(jié)液中NO、SOD及LPO水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。治療6周后2組NO和LPO均降低，SOD水平升高，且觀察組降低/升高優(yōu)于對(duì)照組 (P<0.01)，見表7。

表7 2組患者治療前后NO誘導(dǎo)凋亡因子比較

3 討 論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為[6]，關(guān)節(jié)軟骨變形、丟失，軟骨下骨和關(guān)節(jié)邊緣骨質(zhì)再生是KOA的重要特征，且關(guān)節(jié)軟骨是該病的始發(fā)部位，因此治療過程中，在保證疼痛減輕、疾病進(jìn)展得到控制的同時(shí)，更應(yīng)該促進(jìn)軟骨組織的修復(fù)。本研究結(jié)果表明，硫酸氨基葡萄糖聯(lián)合依托考昔和單獨(dú)使用依托考昔均有顯著療效，且兩者聯(lián)合用藥療效優(yōu)于單獨(dú)使用依托考昔，該結(jié)果與以往諸多文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致[7]。此外本研究發(fā)現(xiàn)，硫酸氨基葡萄糖鉀聯(lián)合依托考昔治療KOA能夠更好地調(diào)節(jié)患者骨代謝指標(biāo)以延緩或阻止關(guān)節(jié)退變，促進(jìn)生長(zhǎng)因子分泌以修復(fù)軟骨組織，進(jìn)而改善關(guān)節(jié)功能。存在于人體關(guān)節(jié)軟骨中的氨基葡萄糖是氨基聚糖合成過程中所需的基本物質(zhì)，口服硫酸氨基葡萄糖鉀可使軟骨基質(zhì)直接得到補(bǔ)充，軟骨降解減緩，利于軟骨蛋白合成及軟骨細(xì)胞基質(zhì)分泌功能恢復(fù)，進(jìn)而使關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)改善[8]。依托考昔能選擇性抑制環(huán)氧合酶、前列腺素的合成，發(fā)揮抗炎作用，從而使關(guān)節(jié)腫脹疼痛等癥狀有效緩解[9]。

大量研究表明，炎性反應(yīng)為KOA的主要病理特征，炎性因子是破壞關(guān)節(jié)軟骨及引發(fā)腫脹、疼痛的重要因素，且炎性因子主要通過一系列的級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)發(fā)揮作用[10-13]。IL-1β可促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶的分泌，進(jìn)而導(dǎo)致軟骨細(xì)胞基質(zhì)降解，軟骨細(xì)胞凋亡[14]。IL-17通過對(duì)軟骨細(xì)胞的分解代謝發(fā)揮強(qiáng)力誘導(dǎo)作用，從而促進(jìn)軟骨降解，此外還能刺激IL-6生成，間接促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶的分泌[14]。IL-18則具有誘導(dǎo)一氧化氮、前列腺素E2等產(chǎn)生的作用，進(jìn)而參與KOA炎性反應(yīng)發(fā)生、關(guān)節(jié)損傷的過程[15-16]。TNF-α可以使白細(xì)胞被激活并聚集，抑制Ⅱ型膠原和蛋白聚糖的合成，抑制軟骨的自身修復(fù)并促進(jìn)軟骨降解。作為一組金屬依賴性蛋白酶類，基質(zhì)金屬蛋白酶具有降解關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的作用[17-18]。由滑膜細(xì)胞和軟骨細(xì)胞分泌的MMP-3不僅能使多種細(xì)胞外基質(zhì)中的基質(zhì)蛋白底物發(fā)生降解，還能使MMP-9和MMP-13等酶原被激活從而產(chǎn)生級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)，MMP-9通過破壞軟骨基質(zhì)和膠原形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)而使膠原降解，MMP-3和MMP-9協(xié)同作用可加速破壞進(jìn)程，并使膠原軟骨的變化不可逆轉(zhuǎn)。目前最有效的Ⅱ型膠原降解酶MMP-13，可降解各種膠原，直接破壞關(guān)節(jié)軟骨的完整性。本研究結(jié)果提示，硫酸氨基葡萄糖和依托考昔可抑制炎性因子的分泌，進(jìn)而降低基質(zhì)金屬蛋白酶水平，從而減緩軟骨基質(zhì)降解，利于受損軟骨細(xì)胞修復(fù)。以往研究表明[19]，在關(guān)節(jié)炎軟骨破壞過程中，IL-1β可上調(diào)Wnt5a的表達(dá)，而Wnt5a可通過JNK信號(hào)途徑介導(dǎo)而上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)。本研究結(jié)果表明，硫酸氨基葡萄糖聯(lián)合依托考昔治療KOA，在降低IL-1β水平并抑制基質(zhì)金屬蛋白酶過程中，有JNK 和Wnt5a的參與。

作為導(dǎo)致軟骨細(xì)胞凋亡的一條重要途徑，NO誘導(dǎo)的凋亡與NO、LPO和SOD關(guān)系密切[20]。在KOA發(fā)病過程中機(jī)體產(chǎn)生的大量自由基具有促進(jìn)凋亡作用[21]。自由基的重要成員NO通過誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡而加重軟骨細(xì)胞損傷。自由基脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的代謝產(chǎn)物L(fēng)PO，可對(duì)細(xì)胞及細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)造成損傷，該指標(biāo)常用于間接反映自由基對(duì)組織細(xì)胞的損傷程度。SOD可通過歧化作用將體內(nèi)氧自由基清除，還能阻斷細(xì)胞色素C依賴的線粒體凋亡途徑，從而對(duì)滑膜和軟骨細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用。本研究結(jié)果提示，硫酸氨基葡萄糖聯(lián)合依托考昔對(duì)KOA軟骨的修復(fù)作用，可能是通過增加SOD水平，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，而使自由基減少，軟骨細(xì)胞凋亡被抑制，最終對(duì)軟骨起到保護(hù)和修復(fù)的作用。

綜上，硫酸氨基葡萄糖聯(lián)合依托考昔對(duì)KOA軟骨的修復(fù)作用，可能是通過降低炎性因子水平使JNK 和Wnt5a表達(dá)下調(diào)以抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的分泌，進(jìn)而減緩軟骨基質(zhì)的降解；或通過SOD途徑抑制NO誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡。今后將采取構(gòu)建動(dòng)物模型或在細(xì)胞水平進(jìn)行研究，進(jìn)一步驗(yàn)證本結(jié)論。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

朱琳:設(shè)計(jì)研究方案，實(shí)施研究過程，論文撰寫；孫玄靜:提出研究思路，分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，論文審核；陳鵬：課題設(shè)計(jì)；顧向浩、周云: 實(shí)施研究過程，資料搜集整理，論文修改