郭海燕，邢志華，王麗麗，解菊芬

1)山西醫(yī)科大學(xué)汾陽(yáng)學(xué)院臨床系內(nèi)科學(xué)教研室 山西汾陽(yáng) 032200 2)山西省汾陽(yáng)醫(yī)院內(nèi)分泌科 山西汾陽(yáng) 032200 3)山西省汾陽(yáng)醫(yī)院血液內(nèi)科 山西汾陽(yáng) 032200

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病的主要微血管并發(fā)癥，嚴(yán)重威脅患者生命健康。研究[1]顯示，高糖可誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡和氧化損傷，這也是DN發(fā)生發(fā)展的機(jī)制之一。因此，抑制腎小管上皮細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激對(duì)于治療DN或延緩DN發(fā)展具有重要意義。生長(zhǎng)分化因子15(growth differentiation factor 15，GDF15)是一個(gè)分泌蛋白，屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β家族成員，參與心腦血管疾病、腫瘤等的發(fā)生發(fā)展[2-3]。有研究[4]顯示，GDF15可能通過(guò)上調(diào)磷酸化的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶B的表達(dá)，拮抗過(guò)氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。姚新豐[5]報(bào)道稱，GDF15在DN患者血清中表達(dá)升高，診斷DN的敏感度為82.2%，特異度為70.2%，可作為診斷DN的生物學(xué)指標(biāo)。但目前，GDF15基因?qū)δI小管上皮細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激的影響還未知。本研究首先檢測(cè)了DN患者腎組織中GDF15蛋白表達(dá)水平，然后以人腎小管上皮細(xì)胞HK-2為研究對(duì)象，探討了沉默GDF15基因表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激的影響，以期為DN的分子靶向治療提供一定的思路。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象選取2017年12月至2018年5月于山西省汾陽(yáng)醫(yī)院腎內(nèi)科住院并行腎活檢確診的16例DN患者為研究對(duì)象，其中男5例，女11例，年齡39～67(53.5±5.9)歲。以同期16例手術(shù)治療的腎癌患者的癌旁正常組織為對(duì)照，其中男9例，女7例，年齡42～69(56.3±7.5)歲。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意，患者自愿簽署知情同意書(shū)。

1.2細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)試劑人腎小管上皮細(xì)胞株HK-2(中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù))，胎牛血清(FBS)和低糖DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)，四甲基噻唑藍(lán)(MTT)和胰蛋白酶(美國(guó)Sigma公司)，Lipofectamine 2000試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)，膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(propidium iodide，PI)細(xì)胞凋亡試劑盒、二喹啉甲酸(bicinchoninicacid，BCA)蛋白檢測(cè)試劑盒和2',7'-二氯二氫熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)探針(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，兔抗人Bcl-2、Bax和GDF15多克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)，兔抗人Nrf2和血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)多克隆抗體(美國(guó)Abcam公司)，GDF15的小干擾RNA及亂序無(wú)義陰性序列(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)，活性氧簇(ROS)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 復(fù)蘇HK-2細(xì)胞，加入含體積分?jǐn)?shù)10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，于2.5 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5 %CO2、97 %濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3 d更換一次新鮮培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)融合至80%左右時(shí)，吸棄培養(yǎng)基。加入PBS清洗細(xì)胞后，加入2.5 g/L胰蛋白酶溶液消化，傳代培養(yǎng)。

1.3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及效果評(píng)價(jià) 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HK-2細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔1×105個(gè)。當(dāng)細(xì)胞融合至60%時(shí)，參照Lipofectamine 2000試劑盒操作說(shuō)明，分別將GDF15的小干擾RNA(si-GDF15組)及亂序無(wú)義陰性序列(si-NC組)轉(zhuǎn)染至HK-2細(xì)胞。轉(zhuǎn)染12 h后，更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞。Western blot法檢測(cè)兩組細(xì)胞中GDF15蛋白水平，評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)染效果。

1.3.3 細(xì)胞分組及處理 將HK-2細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔1×104個(gè)，分為對(duì)照組(細(xì)胞正常培養(yǎng)48 h)、高糖組(用含25 mmol/L[6]葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基作用48 h)、si-GDF15+高糖組和si-NC+高糖組(轉(zhuǎn)染si-GDF15和si-NC的細(xì)胞均用含25 mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)48 h)。每組均設(shè)9個(gè)復(fù)孔。

1.3.4 Western blot法檢測(cè)各組組織和細(xì)胞中GDF15蛋白表達(dá) 細(xì)胞分組和處理同1.3.3。細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，吸棄培養(yǎng)基，胰蛋白酶消化收集細(xì)胞。RIPA蛋白裂解液提取組織和各組細(xì)胞中總蛋白，BCA法對(duì)蛋白進(jìn)行定量。取適量蛋白，100 ℃煮沸5 min，變性后，每孔30 μg上樣行PAGE電泳。電泳后，濕轉(zhuǎn)至聚偏乙烯二氟膜，于50 g/L脫脂牛奶液中封閉2 h。加入GDF15抗體(按1∶600稀釋)，4 ℃孵育過(guò)夜。洗膜后，加入辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗(按1∶200稀釋)，37 ℃孵育1 h。洗膜后，加入ECL，避光顯影，凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照。以GAPDH為內(nèi)參，用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.3.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率 細(xì)胞分組和處理同1.3.3。PBS清洗細(xì)胞，加入適量2.5 g/L胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞。取1.0×106個(gè)細(xì)胞，PBS清洗后，加入400 μL結(jié)合緩沖液輕輕吹打；加入10 μL Annexin V-FITC，避光孵育10 min；加入5 μL PI室溫孵育5 min；再加入100 μL結(jié)合緩沖液，混勻后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.3.6 各組細(xì)胞內(nèi)ROS含量檢測(cè) 細(xì)胞分組和處理同1.3.3。細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，按照ROS試劑盒說(shuō)明書(shū)，吸棄培養(yǎng)基，加入按1∶500稀釋后的DCFH-DA，37 ℃孵育40 min；用無(wú)血清培養(yǎng)基清洗細(xì)胞3次，胰蛋白酶消化，PBS清洗。PBS重懸細(xì)胞，用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)(激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)525 nm)ROS含量。

1.3.7 各組細(xì)胞內(nèi)MDA、SOD和GSH-Px水平檢測(cè)細(xì)胞分組和處理同1.3.3。細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，用胰蛋白酶消化，PBS清洗、收集。用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，保留上清液，分別參照MDA、SOD和GSH-Px試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)上清中MDA、SOD和GSH-Px水平。

1.3.8 各組細(xì)胞中Bcl-2、Bax、Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)的Western blot法檢測(cè) 細(xì)胞分組和處理同1.3.3。檢測(cè)方法同1.3.4。其中Bcl-2抗體按1∶400稀釋，Bax抗體按1∶400稀釋，Nrf2抗體按1∶600稀釋，HO-1抗體按1∶600稀釋。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用Excel和PEMS 3.2進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。應(yīng)用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較正常腎組織和DN患者腎組織中GDF15蛋白表達(dá)的差異，應(yīng)用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)比較各組細(xì)胞凋亡率、各組細(xì)胞中GDF15、Bcl-2、Bax、Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)以及ROS含量、MDA、SOD和GSH-Px水平的差異。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1正常腎組織和DN患者腎組織中GDF15蛋白表達(dá)的比較見(jiàn)圖1。與正常腎組織(0.45±0.04)比較，DN患者腎組織(0.81±0.07)中GDF15蛋白表達(dá)水平升高(t=17.861，P<0.001)。

1：正常腎組織；2：DN患者腎組織

2.2高糖對(duì)HK-2細(xì)胞GDF15蛋白表達(dá)的影響見(jiàn)圖2。與對(duì)照組(0.43±0.02)比較，高糖組HK-2細(xì)胞(0.87±0.05)中GDF15蛋白表達(dá)水平升高(t=24.512，P<0.001)。

1：對(duì)照組;2：高糖組

2.3GDF15小干擾RNA轉(zhuǎn)染效果驗(yàn)證結(jié)果見(jiàn)圖3。與si-NC組(0.45±0.05)比較，si-GDF15組(0.19±0.03)HK-2細(xì)胞中GDF15蛋白表達(dá)水平降低(t=13.377，P<0.001)。

1：si-NC組；2：si-GDF15組

2.4沉默GDF15表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞凋亡的影響見(jiàn)圖4。高糖組HK-2細(xì)胞凋亡率高于對(duì)照組(P<0.05)。si-GDF15+高糖組HK-2細(xì)胞凋亡率低于si-NC+高糖組(P<0.05)。高糖組與si-NC+高糖組細(xì)胞凋亡率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.5沉默GDF15表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響見(jiàn)表1。由表1可知，與對(duì)照組比較，高糖組和si-NC+高糖組MDA和ROS水平升高(P<0.05)，SOD和GSH-Px水平降低(P<0.05)。與si-NC+高糖組比較，si-GDF15+高糖組MDA和ROS水平降低(P<0.05)，SOD和GSH-Px水平升高(P<0.05)。高糖組與si-NC+高糖組比較，各檢測(cè)指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1：對(duì)照組；2：高糖組；3：si-NC+高糖組；4：si-GDF15+高糖組。*：與對(duì)照組比較，P<0.05；#：與si-NC+高糖組比較，P<0.05

圖4 沉默GDF15表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞凋亡率的影響

表1 各組HK-2細(xì)胞中MDA、ROS、SOD和GSH-Px水平的變化(n=9)

*：與對(duì)照組比較，P<0.05； #：與si-NC+高糖組比較，P<0.05

2.6沉默GDF15表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響見(jiàn)圖5和表2。高糖組和si-NC+高糖組HK-2細(xì)胞中Bax蛋白水平高于對(duì)照組(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平低于對(duì)照組(P<0.05)。si-GDF15+高糖組HK-2細(xì)胞中Bax蛋白水平低于si-NC+高糖組(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平高于si-NC+高糖組(P<0.05)。高糖組與si-NC+高糖組Bax和Bcl-2蛋白水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1：對(duì)照組；2：高糖組；3：si-NC+高糖組；4：si-GDF15+高糖組

圖5 沉默GDF15對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞中Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)影響

*：與對(duì)照組比較，P<0.05； #：與si-NC+高糖組比較，P<0.05

2.7沉默GDF15表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞Nrf2/HO-1信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響見(jiàn)圖6和表3。高糖組和si-NC+高糖組細(xì)胞質(zhì)Nrf2蛋白水平低于對(duì)照組(P<0.05)，HO-1和細(xì)胞核Nrf2蛋白水平高于對(duì)照組(P<0.05)。si-GDF15+高糖組HO-1和細(xì)胞核Nrf2蛋白水平高于si-NC+高糖組(P<0.05)，細(xì)胞質(zhì)Nrf2蛋白水平低于si-NC+高糖組(P<0.05)。高糖組與si-NC+高糖組HO-1和細(xì)胞核Nrf2蛋白水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1：對(duì)照組；2：高糖組；3：si-NC+高糖組；4：si-GDF15+高糖組

圖6 沉默GDF15對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)的影響

*：與對(duì)照組比較，P<0.05； #：與si-NC+高糖組比較，P<0.05

3 討論

隨著人們飲食習(xí)慣的改變，糖尿病的發(fā)病率呈現(xiàn)增長(zhǎng)的趨勢(shì)，DN作為糖尿病的常見(jiàn)并發(fā)癥被廣泛關(guān)注。腎小管上皮細(xì)胞是腎臟的固有細(xì)胞之一，在葡萄糖、炎性因子、缺氧等因素誘導(dǎo)時(shí)會(huì)產(chǎn)生氧化應(yīng)激和凋亡，最終導(dǎo)致腎小管間質(zhì)纖維化，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致腎功能衰竭[7]。因此，腎小管上皮細(xì)胞的凋亡和氧化應(yīng)激與DN的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

GDF15是一種應(yīng)激反應(yīng)蛋白，參與調(diào)控細(xì)胞凋亡[8]。研究[9]顯示，GDF15在DN患者血清中的水平明顯高于單獨(dú)糖尿病人群和健康人群，是影響DN的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。目前，還未見(jiàn)GDF15影響腎小管上皮細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激的相關(guān)報(bào)道。本研究首先檢測(cè)了DN患者腎組織中GDF15蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示，GDF15蛋白在DN患者腎組織中呈高表達(dá)，提示GDF15可能參與DN的發(fā)生發(fā)展。進(jìn)一步使用高糖誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞HK-2后，細(xì)胞中GDF15蛋白表達(dá)水平升高；通過(guò)轉(zhuǎn)染GDF15小干擾RNA沉默GDF15表達(dá)后，高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞凋亡率和Bax蛋白水平明顯降低，Bcl-2蛋白水平明顯升高，提示沉默GDF15基因表達(dá)可能通過(guò)調(diào)控Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)抑制高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞凋亡。

高糖環(huán)境下，腎小球細(xì)胞內(nèi)氧化作用增強(qiáng)，抗氧化與氧化平衡被打破，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量ROS[10]。ROS進(jìn)一步造成細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化，損傷細(xì)胞膜。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物之一，可間接反映脂質(zhì)過(guò)氧化水平[11]。SOD是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化酶，可清除氧自由基，保護(hù)機(jī)體免受氧化損傷。GSH-Px也是一種抗氧化酶，可與SOD協(xié)同作用，減少活性氧自由基的產(chǎn)生，防止脂質(zhì)過(guò)氧化及其中間代謝產(chǎn)物對(duì)機(jī)體的損害，維持體內(nèi)的氧化和抗氧化平衡[12]。本研究顯示，高糖處理后HK-2細(xì)胞ROS和MDA水平升高，SOD和GSH-Px水平降低，說(shuō)明高糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞產(chǎn)生了氧化應(yīng)激反應(yīng)。沉默GDF15基因表達(dá)后，高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞ROS和MDA水平降低，SOD和GSH-Px水平升高，提示沉默GDF15基因可減輕高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。

Nrf2/HO-1信號(hào)通路在細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡中發(fā)揮重要作用，是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化信號(hào)通路[13]。正常生理?xiàng)l件下，Nrf2與其抑制蛋白Keap1在細(xì)胞質(zhì)中形成復(fù)合物。當(dāng)受到氧化應(yīng)激刺激時(shí)，Nrf2磷酸化與Keap1發(fā)生解離，并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，進(jìn)而啟動(dòng)HO-1基因的轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮抗氧化作用，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷[14]。本研究顯示，沉默GDF15基因表達(dá)后，高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞HO-1和細(xì)胞核Nrf2蛋白水平明顯升高，細(xì)胞質(zhì)Nrf2蛋白水平明顯降低，提示沉默GDF15基因表達(dá)可激活Nrf2/HO-1信號(hào)通路，減輕高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞氧化應(yīng)激等損傷。

綜上所述，高糖可促進(jìn)人腎小管上皮細(xì)胞HK-2中GDF15表達(dá)，沉默GDF15基因表達(dá)可減少高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞凋亡、減輕氧化應(yīng)激，其可能通過(guò)激活Nrf2/HO-1信號(hào)通路，保護(hù)HK-2細(xì)胞免受損傷，為DN的靶向分子治療提供了新思路。