蘇玲 宮磊 尹向田

摘要 以貴妃玫瑰葡萄為試材，研究不同消毒時間、取材部位、外植體大小以及不同濃度植物激素對增殖和生根培養(yǎng)的影響，優(yōu)化組培快繁技術(shù)，以期為優(yōu)良鮮食葡萄品種的快速繁殖提供依據(jù)。結(jié)果表明，最適宜的外植體消毒條件是用0.5%的次氯酸鈉溶液消毒15 min;外植體的最佳取材部位為中部莖段;選用外植體長度和粗度分別為2～<3 cm和0.5～0.8 cm時，組培快繁的效果最佳;增殖培養(yǎng)過程中，最理想的6-BA濃度為1.0 mg /L;生根培養(yǎng)過程中最適IBA濃度為0.5 mg/L。

關(guān)鍵詞 葡萄;組織培養(yǎng);快繁;技術(shù)

Abstract In this experiment，taking the Guifeimeigui grape as the test material，the effects of different disinfection time，sampling position，explants size and different concentrations of plant hormones on the proliferation and rooting culture were studied.Tissue culture and rapid propagation technology were optimized to provide reference for the rapid propagation of excellent fresh grape varieties.The results showed that the best sterilizing condition was to sterilize the explants with 0.5% sodium hypochlorite solution for 15 minutes;the best sampling parts of explants were the middle stem segments;when the length and thickness of explant were 2-<3 cm and 0.5-0.8 cm respectively，the effect of tissue culture and rapid propagation was the best.During the proliferation culture，the optimal concentration of 6-BA was 1.0 mg/L;the optimum IBA concentration during rooting culture was 0.5 mg/L.

Key words Grape;Tissue culture;Rapid propagation;Technology

葡萄作為重要的經(jīng)濟(jì)類果樹作物之一，具有悠久的栽培歷史和豐富多樣的品種，是世界第二大水果[1-2]。我國作為世界葡萄 （Vitis vinifera L.）的生產(chǎn)大國之一，葡萄的栽培面積和產(chǎn)量均居世界前列。由于葡萄的遺傳背景相對復(fù)雜，應(yīng)用傳統(tǒng)的育種方式周期長，且新品種的培育較困難;通過扦插或嫁接等方法進(jìn)行無性繁殖育苗，受到區(qū)域、季節(jié)變化的局限，周期也較長且易積累病害[3]。多年來，利用組織培養(yǎng)繁育優(yōu)良苗木品種一直是葡萄育種的研究重點[4-5]。植物組織培養(yǎng)技術(shù)能夠不受季節(jié)限制，快速繁殖優(yōu)質(zhì)葡萄苗木，同時降低成本。因此，建立有效的鮮食葡萄品種組培快繁體系，不僅可滿足優(yōu)質(zhì)苗木的商業(yè)化生產(chǎn)需求，還能為優(yōu)質(zhì)葡萄市場提供技術(shù)參考。

貴妃玫瑰，歐亞種，原產(chǎn)我國。該品種穗形整齊，果皮薄，無澀味，果肉質(zhì)地軟，充分成熟有淡玫瑰香味，品質(zhì)中上，產(chǎn)量高，具有較好的品種特性[6]。近年來，葡萄設(shè)施栽培壯大，該品種也是一個適合設(shè)施栽培的早熟品種?？焖贁U(kuò)繁該品種，有助于獲得較高的經(jīng)濟(jì)價值。由于傳統(tǒng)繁殖方式的局限性，需要通過組織離體培養(yǎng)的方法來實現(xiàn)其快速繁殖。植物組織培養(yǎng)作為育種技術(shù)，在育種、資源保存和生產(chǎn)等方面已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用[7]。雖然葡萄組培快繁應(yīng)用廣泛，但在貴妃玫瑰葡萄上的研究和應(yīng)用報道很少。該研究以貴妃玫瑰葡萄的嫩枝為研究對象，以MS作為基本培養(yǎng)基，對貴妃玫瑰組培技術(shù)條件進(jìn)行篩選，從而獲得合適的培養(yǎng)體系，為利用組培體系進(jìn)行快速育苗研究提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 2018年6月上旬，取自山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院濟(jì)陽試驗基地葡萄園貴妃玫瑰葡萄的當(dāng)年生新梢。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基及配制?；九囵B(yǎng)基采用 MS和1/2MS，添加6-BA和IBA，調(diào)整 pH 至 5.8～6.0，121 ℃高壓滅菌 20 min。

1.2.2 試材消毒。

選取半木質(zhì)化的枝條莖段為外植體，剪掉病、蟲、長勢弱的枝和葉片，首先用流水沖洗2 h后，用75%酒精消毒10 s，無菌水沖洗 2～3 次，再用0.5 %次氯酸鈉分別消毒5、10、15和20 min，無菌水沖洗 4～5 遍，最后用滅菌的濾紙吸去表面多余水分，分別接種于MS 培養(yǎng)基上，每個處理接種20個莖段，重復(fù)3次。設(shè)置如下培養(yǎng)條件：光照時間16 h/d，光照強(qiáng)度2 000 Lx，溫度25 ℃，空氣相對濕度 40%～60%。并在1個月后統(tǒng)計芽的成活率。

1.2.3 單芽莖段的處理。

外植體消毒后，分別選取處于頂梢、中上部和基部的單芽莖段各30個接種于MS 培養(yǎng)基上，重復(fù)3次，并在1個月后統(tǒng)計芽的成活率。

選擇消毒外植體莖，將其剪成長度為 2～<3、3～<4、4～<5 cm，再按粗細(xì)分為直徑小于 0.5 cm、0.5～0.8 cm、大于0.8 cm 的單芽莖段，分別接種于MS 培養(yǎng)基上，每個處理接種30個莖段，重復(fù) 3 次。觀察其生長情況，并在1個月后統(tǒng)計芽的萌發(fā)率。

1.2.4 增殖和生根培養(yǎng)基的選擇。

選擇培養(yǎng)獲得的無菌單芽莖段芽（長度1.5cm 左右），分別接種于添加6-BA和IAA 2種植物激素的增殖培養(yǎng)基中，并設(shè)定3個濃度梯度的6-BA，分別為0.5、1.0和2.0 mg/L，IAA濃度為0.1 mg/L。每種培養(yǎng)基中接種20個莖段，重復(fù)3次，1個月后觀察并統(tǒng)計生長和增殖情況。

將長勢健壯的無菌組培苗接種于含有不同濃度（0、0.2、0.5和1.0 mg/L）IBA的1/2MS培養(yǎng)基上，1個月后觀察并統(tǒng)計生根率和生根情況。

1.2.5 煉苗和移栽。

待組培苗長至5～7 cm，帶有5片左右葉片時，將幼苗連瓶子一起置于20～28 ℃的溫室中煉苗2～3 d，再去掉瓶塞，然后在自然光下煉苗4～7 d（需從室內(nèi)到室外慢慢過渡），當(dāng)試管苗不再萎蔫即可出瓶。用鑷子小心夾取植株，用干凈的溫水洗凈組織培養(yǎng)苗植株根部的培養(yǎng)基，移栽于準(zhǔn)備好的基質(zhì)中，控制移栽時空氣濕度95%以上、溫度25 ℃左右。

2 結(jié)果與分析

2.1 消毒時間對成活率的影響

不同消毒時間處理下，統(tǒng)計外植體的成活率、污染率和褐死率。結(jié)果顯示，消毒15 min時，外植體成活率最高，達(dá)到86.67%，污染率和褐死率分別為5.00%和8.33%（圖1）。表1還表明，隨著消毒時間的延長，外植體的污染率逐漸降低，而褐死率逐漸升高。綜上表明，消毒15 min時，更適宜于外植體的成活。

2.2 取材部位對發(fā)芽率的影響

分別對取于頂梢、中部和基部莖段的外植體發(fā)芽率進(jìn)行統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)基部部位的外植體發(fā)芽率達(dá)63.33%，中部部位和頂梢的外植體發(fā)芽率分別達(dá)87.78%和53.33%（圖2）。結(jié)果表明，處于中部部位的外植體發(fā)芽率最高。因此，外植體的取材部位為中部莖段時最有利于貴妃玫瑰葡萄的離體組織培養(yǎng)。

2.3 外植體長度和粗度對發(fā)芽率的影響

將不同外植體長度在 2～5 cm 的莖段接種后統(tǒng)計發(fā)芽率，結(jié)果如圖3所示，當(dāng)外植體長度在 2～<3、3～<4、4～<5 cm 時，萌芽率分別為 90.00 %、77.78 %和67.78%。由此表明，隨著外植體長度的增加，其發(fā)芽率降低。上述結(jié)果表明，外植體長度處于2～<3 cm 時發(fā)芽最好。

同時對處于不同粗度外植體的發(fā)芽率也進(jìn)行了統(tǒng)計。發(fā)現(xiàn)小于0.5、0.5～0.8 cm、大于0.8 cm的外植體的發(fā)芽率分別是66.67%、88.89%和62.22%（圖4）。處于中間粗度的外植體發(fā)芽率明顯高于另2種粗度。由此說明，當(dāng)外植體的粗度處于0.5～0.8 cm時，其發(fā)芽率最高。

2.4 激素6-BA濃度影響貴妃玫瑰增殖的分析

將單芽莖段芽分別接種于含不同濃度6-BA的3種增殖培養(yǎng)基（MS+6-BA 0.5 mg/L+IAA 0.1 mg/L，MS+6-BA 1.0 mg/L+IAA 0.1 mg/L，MS+6-BA 2.0 mg/L+IAA 0.1 mg/L）中，40 d左右后統(tǒng)計其增殖系數(shù)，結(jié)果如圖5所示。6-BA濃度為0.5、1.0和2.0 mg/L 時，貴妃玫瑰的增殖系數(shù)分別是1.85、2.92和2.98，由此表明，隨著6-BA濃度的增加，貴妃玫瑰的增殖率呈上升趨勢，但濃度為1.0和2.0 mg/L時，其增殖系數(shù)相差較小，且前者植株長勢的整齊度高于后者。因此，建議選擇1.0 mg/L 6-BA的濃度用于貴妃玫瑰的增殖培養(yǎng)。

2.5 激素IBA濃度對貴妃玫瑰生根培養(yǎng)的影響

以貴妃玫瑰無菌組培苗為材料，將其接種于含有不同濃度IBA的生根培養(yǎng)基（A：1/2MS，B：1/2MS+IBA 0.2mg/L，C：1/2MS+IBA?妃玫瑰組培苗生根的影響。由表1和圖6可知，生根培養(yǎng)基中加入IBA后，組培苗的生根率得到提高。當(dāng)IBA濃度為0.2 mg/L，組培苗的葉片和根的生長情況較好，且生根率也較高，當(dāng)IBA濃度為0.5 mg/L時，組培苗達(dá)到最優(yōu)生長和生根狀況。當(dāng)IBA濃度達(dá)到1.0 mg/L時，雖然葉片和根的生長情況較好，但是生根率明顯下降。由此表明，最適宜貴妃玫瑰生根的IBA濃度為0.5 mg/L。

3 討論

外植體的生長發(fā)育情況及對其消毒時間的長短，對組培繁育有很大影響[8-9]。外植體消毒作為組織培養(yǎng)的第一步，具有重要作用，不同的消毒處理時間對發(fā)芽率尤為重要[10]。該試驗中，0.5%次氯酸鈉消毒15 min，對無菌培養(yǎng)具有良好

的促進(jìn)作用。外植體的生長情況也取決于取材的時間。取培養(yǎng)基類型Medium type每株葉片數(shù)Number of leaves per plant∥片株高Plant height∥cm每株根數(shù)Number of roots per plant∥條平均根長Average root lergth∥cm生根率Rooting rate∥%材時間過早，外植體的半木質(zhì)化程度低，消毒時容易發(fā)生褐化;取材時間過晚，雨季天氣來臨，病菌種類變多且繁殖活躍，新稍的增殖減慢，不利于快繁體系的建立。

營養(yǎng)物質(zhì)直接影響組培苗的生長狀況[11]，因此培養(yǎng)基組分對增殖和生根培養(yǎng)的作用尤為顯著。植物激素作為調(diào)控植物生長的活性物質(zhì)，在細(xì)胞分裂與伸長、組織與器官分化、開花與結(jié)實、成熟與衰老、休眠與萌發(fā)以及離體組織培養(yǎng)等方面都具有重要作用[12-14]。研究表明，外源和內(nèi)源激素能夠相互平衡，更好地調(diào)節(jié)植物生長和發(fā)育，由此在組培過程中有必要在培養(yǎng)基中添加一定量的植物激素來調(diào)控生長和分化[15]。該試驗的增殖和生根過程中，分別選用MS和1/2MS作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別選用6-BA和IBA作為生長調(diào)節(jié)劑。研究發(fā)現(xiàn)，加入1.0 mg/L 6-BA時，外植體生長狀況良好，但當(dāng)6-BA 濃度增大到2.0 mg/L時，增殖培養(yǎng)的外植體雖然增殖系數(shù)較好，但是易出現(xiàn)畸形，添加活性炭也可以明顯減輕褐變，有利于外植體生長，濃度一般為0.1%～0.3%[16]。研究表明，單獨(dú)使用IBA 可促進(jìn)組培苗的生根。白瑞興等[17]選用大量元素減半的B5培養(yǎng)基中添加0.2～0.5 mg/L IAA，成苗率高且植株生長健壯。該試驗中，加入不同濃度的IBA均可促進(jìn)組培苗的生根，且濃度為0.5 mg/L最佳。另外，齊永順等[18-19]研究表明，內(nèi)源激素水平對植物生根發(fā)育也具有重要作用，在生根誘導(dǎo)過程中，根的伸長、加粗均受到IAA、ABA等內(nèi)源激素的調(diào)控。該研究在貴妃玫瑰的生根誘導(dǎo)過程中，發(fā)現(xiàn)IBA濃度增加至1.0 mg/L時，生根數(shù)和生根率都很好，但形成大量的愈傷組織且生根分布不均，其原因還需進(jìn)一步研究。

4 總結(jié)

該研究主要對貴妃玫瑰組織培養(yǎng)過程中外植體的選擇和繼代培養(yǎng)的激素濃度進(jìn)行了探討，初步確定了貴妃玫瑰組織培養(yǎng)的技術(shù)體系。但是，試驗中增殖生根誘導(dǎo)時關(guān)于激素配比還需要進(jìn)一步探究，以期為葡萄苗木的標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)提供更多的依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1] 金萬梅，董靜，閆愛玲，等.葡萄器官離體再生和遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立[J].園藝學(xué)報，2008，35（1）：27-32.

[2] 楊曉明.葡萄體胚發(fā)生、遺傳穩(wěn)定性及其多倍體植株再生研究[D].蘭州：蘭州大學(xué)，2007.

[3] SIM S T，AL RWAHNIH M，ROWHANI A，et al.Virus elimination from grape selections using tissue culture at Foundation Plant Services，University of California，Davis[C]//Proceedings of the 17th Congress of ICVG.Davis，USA：University of California Davis，2012：262-263.

[4] 李國樹，邱璐，徐成東，等.葡萄組織培養(yǎng)快速繁殖體系研究[J].北方園藝，2011（9）：134-136.