胡愛(ài)妮 王豫萍 楊梅# 路毅斌 崔麗麗 郝杰

(1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，貴州 貴陽(yáng) 550003;2.貴州醫(yī)科大學(xué)，貴州 貴陽(yáng) 550004)

妊娠糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)指在妊娠期發(fā)生或首次出現(xiàn)的不同嚴(yán)重程度的糖耐量異常[1]。是婦女妊娠期特有的疾病，也是妊娠期最常見(jiàn)的并發(fā)癥之一。近來(lái)流行病學(xué)調(diào)查顯示，GDM孕婦的比例呈現(xiàn)不斷上升趨勢(shì)，有超過(guò)80%的糖尿病孕婦被診斷為GDM?；加蠫DM的婦女為高危妊娠，患者可有多種并發(fā)癥，導(dǎo)致孕婦和胎兒很多的不良后果[2-4]，所以GDM的篩查、診斷和管理的意義重大，早期及時(shí)的診斷和血糖濃度的控制可以使GDM患者得到及時(shí)的治療，大大地減少母嬰并發(fā)癥的發(fā)生[5]。GDM的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，與遺傳因素、環(huán)境因素及生活方式有關(guān)，還有許多發(fā)病機(jī)制和2型糖尿病類似和共享。既往研究證實(shí)了GDM和胰島素抵抗相關(guān)性以及胰島β細(xì)胞的去分化機(jī)制[6]，以及GDM孕婦的胎盤和大網(wǎng)膜脂肪組織中FOXO1的表達(dá)與胰島素抵抗的關(guān)系[7]。因此，本研究通過(guò)觀察GDM孕婦和正常孕婦外周血FOXO1基因表達(dá)情況，及其與胰島素的關(guān)系，為血清中FOXO1基因的檢測(cè)作為一項(xiàng)新的GDM早期診斷的參考指標(biāo)和治療的靶分子提供依據(jù)，對(duì)GDM的早診斷、早治療，減少母嬰的不良并發(fā)癥有重要意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取本院產(chǎn)科門診進(jìn)行產(chǎn)檢的孕婦108例作為研究對(duì)象，根據(jù)近年來(lái)相關(guān)參考文獻(xiàn)[8-11]和統(tǒng)計(jì)學(xué)意義分析，將其分為GDM研究組(n=57)和正常對(duì)照組(n=51)，GDM研究組年齡(29.76±3.19)歲，孕周(25.37±1.84)周，孕前體質(zhì)量(51.14±4.23) kg；正常對(duì)照組年齡(28.84±3.81)歲，孕周(25.16±2.26)周，孕前體質(zhì)量(50.09±3.94) kg。其中診斷GDM的參考標(biāo)準(zhǔn)參考在國(guó)際糖尿病和妊娠協(xié)會(huì)研究組(IADPSG)基于HAPO結(jié)果，于2010年提出的最新GDM診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]診斷標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)顯性糖尿病診斷的孕婦應(yīng)接受75 g葡萄糖耐量試驗(yàn)(OGTT)，孕周24～28周進(jìn)行，試驗(yàn)前3 d正常飲食，正常體力活動(dòng)，試驗(yàn)前1 d，晚餐后禁食8～14 h至次日清晨抽血化驗(yàn)?？崭埂?.1 mmol/L，1 h≥10 mmol/L，2 h≥8.5 mmol/L，有1項(xiàng)或以上達(dá)到或超過(guò)標(biāo)準(zhǔn)則診斷為GDM[12]。入選對(duì)象需排除孕前有糖尿病、高血壓病、肝腎功能不全、多囊卵巢綜合征、垂體腎上腺、甲狀腺等內(nèi)分泌疾病，孕前及孕期使用皮質(zhì)激素類藥物、多胎、胎兒畸形、胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)受限或死胎史，輔助生殖技術(shù)受孕，有飲酒不良嗜好等。兩組孕婦一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。

1.2主要試劑 葡萄糖測(cè)定試劑盒購(gòu)自北京九強(qiáng)生物技術(shù)股份有限公司；胰島素試劑盒購(gòu)自羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司；FOXO1的ELISA試劑盒和RT-PCR試劑購(gòu)自寶生物工程有限公司。

1.3方法 血糖測(cè)定：利用TBA120生化分析儀葡萄糖氧化酶法進(jìn)行血糖的測(cè)定。血清空腹胰島素(FINS)水平測(cè)定：利用羅氏411檢測(cè)儀電化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行胰島素的測(cè)定。FOXO1的基因表達(dá)測(cè)定：實(shí)時(shí)定量熒光PCR(RT-PCR)法檢測(cè)，先根據(jù)Trizol試劑盒說(shuō)明書提取外周血RNA[13]，再利用Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)查詢基因序列，利用引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物，利用TB Green嵌合熒光法進(jìn)行FOXO1 mRNA的逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增，測(cè)量和對(duì)照。ELASA法測(cè)定FOXO1蛋白表達(dá)：設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)孔、樣本孔和空白孔，其中標(biāo)準(zhǔn)孔加有不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL；待測(cè)樣本孔先加樣品稀釋液40 μL，然后再加待測(cè)樣品10 μL(樣品最終稀釋度為5倍)；進(jìn)行溫育、重復(fù)洗滌5次；除空白孔外，每孔加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗體試劑50 μL，再進(jìn)行溫育和重復(fù)洗滌5次；每孔加入顯色劑A、B各50 μL，37 ℃避光顯色15 min，再每孔加終止液50 μL，終止反應(yīng)；以空白孔調(diào)零，450 nm波長(zhǎng)依序測(cè)定各孔的吸光度(OD值)并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。利用測(cè)定的空腹血糖和空腹胰島素來(lái)計(jì)算穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)=空腹胰島素(mU/L)×空腹血糖(mmol/L)/22.5。

2 結(jié) 果

2.1兩組孕婦血清中胰島素水平比較 GDM研究組的血清FINS表達(dá)水平和HOMA-IR明顯高于正常對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩組孕婦血清中胰島素水平比較

2.2兩組孕婦血清中FOXO1表達(dá)水平比較 GDM研究組外周血中FOXO1的mRNA和蛋白的表達(dá)水平均高于正常對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)表2、表3。

表2 兩組孕婦外周血FOXO1 mRNA表達(dá)水平比較

表3 兩組孕婦外周血FOXO1蛋白表達(dá)水平比較

2.3相關(guān)分析 GDM孕婦外周血FOXO1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平均與胰島素抵抗HOMA-IR呈正相關(guān)(r=0.555、0.530，P<0.05)。

3 討 論

流行病學(xué)調(diào)查顯示，GDM孕婦的比例呈現(xiàn)不斷上升趨勢(shì)，影響了全球的妊娠期婦女，處于一種高風(fēng)險(xiǎn)狀態(tài)，雖然大多數(shù)GDM孕婦的糖代謝在產(chǎn)后可以恢復(fù)正常，但目前有證據(jù)顯示，患有GDM的婦女為高危妊娠，患者可有多種并發(fā)癥[2-4]，目前認(rèn)為，GDM的發(fā)病機(jī)制雖然復(fù)雜，但其與2型糖尿病類似，即遺傳基因缺陷基礎(chǔ)上存在胰島分泌功能不足和胰島素抵抗(insulin resist，IR)。其中IR在GDM發(fā)生發(fā)病過(guò)程中占主要地位，故治療IR已成為控制和治療高血糖的關(guān)鍵措施[14-15]。FOXO1是FOXO家族中最早被發(fā)現(xiàn)的成員之一，它的主要功能是作為磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)的底物，對(duì)胰島素的信號(hào)傳導(dǎo)起著負(fù)性調(diào)節(jié)的作用[16]，對(duì)糖尿病的發(fā)展起重要作用。因此通過(guò)近年來(lái)大量的研究[17-20]顯示，F(xiàn)OXO1在2型糖尿病的遺傳易感性和基因多態(tài)性表達(dá)的研究已成為眾多學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)，特別是在胰島素抵抗相關(guān)性和胰島β細(xì)胞的去分化方面。并且GDM和2型糖尿病共享許多類似的發(fā)病機(jī)制，研究[6]證實(shí)了GDM和胰島素抵抗相關(guān)性以及胰島β細(xì)胞的去分化機(jī)制。徐玉紅等[7]已在GDM孕婦的胎盤和大網(wǎng)膜脂肪組織中研究到了FOXO1的表達(dá)，及其與IR的關(guān)系，證實(shí)了GDM孕婦胎盤和大網(wǎng)膜脂肪組織中FOXO1的mRNA和蛋白表達(dá)都比正常組高，且與胰島素水平和IR呈正相關(guān)。由此推測(cè)FOXO1基因可能是GDM重要的發(fā)病機(jī)制之一，在GDM的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，可以導(dǎo)致胰島β細(xì)胞的去分化，從而影響胰島素的分泌和產(chǎn)生IR，引起胰島素不足，血糖升高，但GDM孕婦外周血方面的相關(guān)研究目前幾乎未見(jiàn)。所以本次研究通過(guò)比較研究組GDM孕婦和正常對(duì)照組孕婦外周血胰島素表達(dá)水平、FOXO1基因和蛋白表達(dá)水平差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；以及探索FOXO1表達(dá)水平與胰島素抵抗HOMA-IR的相關(guān)性來(lái)分析GDM孕婦血清中FOXO1基因和蛋白的表達(dá)，及其與GDM發(fā)病機(jī)制的關(guān)系。

本研究結(jié)果顯示GDM孕婦外周血中胰島素，F(xiàn)OXO1的mRNA和蛋白的表達(dá)水平均高于正常孕婦對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明胰島素和FOXO1基因都參與了孕婦GDM的發(fā)生發(fā)展。并且FOXO1的mRNA和蛋白表達(dá)水平與胰島素抵抗指數(shù)呈正相關(guān)，由此可推測(cè)FOXO1參與GDM的發(fā)病機(jī)制可能是通過(guò)增加孕婦體內(nèi)的胰島素抵抗性來(lái)實(shí)現(xiàn)的。因此，作為一項(xiàng)外周血的檢查，F(xiàn)OXO1基因和蛋白的檢測(cè)可作為一項(xiàng)新的GDM早期診斷的參考指標(biāo)，并且還可以給GDM的靶分子治療提供新的依據(jù)，對(duì)GDM的早診斷、早治療，減少母嬰的不良并發(fā)癥有重要意義。