華海俠 趙敏 顧濤 付占昭 白立立 劉瑞吉

研究表明，血清應(yīng)答因子(serum response factor,SRF)在癌組織中高表達(dá)，伴隨著E-鈣粘蛋白(E-cadherin)、β-catenin(β-連環(huán)蛋白)表達(dá)的下調(diào)，與浸潤深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，提示SRF可能是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的重要調(diào)控機制之一[1]。SRF調(diào)控基因表達(dá)的主要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有兩條：一是與增殖有關(guān)的有絲分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號，另外一條調(diào)控通路是Rho信號依賴的肌動蛋白的細(xì)胞動力學(xué)改變，提示SRF與腫瘤細(xì)胞增殖和細(xì)胞動力學(xué)改變可能有一定的關(guān)聯(lián)[2]。因此本研究擬采用RNA干擾技術(shù)，構(gòu)建多條特異性的針對SRF的siRNA并轉(zhuǎn)染入肺癌A549細(xì)胞，采用realtime PCR篩選出干擾效率最高的siRNA-SRF。采用CCK-8法、流式細(xì)胞檢測、侵襲實驗、westernblot等方法，觀察SRF表達(dá)的下調(diào)與細(xì)胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系，進(jìn)一步研究SRF在肺癌細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移中的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料 A549細(xì)胞株購自于中科院上海細(xì)胞庫；siRNA構(gòu)建及合成購自于上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)耗材耗材購自于廣州潔特生物過濾制品有限公司；CCK-8細(xì)胞增殖試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所)；SRF一抗(sc-335，美國Santa Cruz公司)；Trizol及PCR相關(guān)試劑(美國Invitrogen公司)；免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染:由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計并合成4條針對SRF基因的小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)，各組基因序列詳為：①SRF-900：sense：5’-GCCGCGUGAAGAUCAAGAUTT-3’，anti-sense：5’-AUCUUGAUCUU CACGCGGCTT-3’；②SRF-951：sense：5’-CGACCUUCAGCAAGAGGAATT-3’，anti-sense：5’-UUCCUCUUGCUCAAGGUCGTT-3’；③SRF-1107：sense：5’-GCAAGGCACUGAUUCAGACTT-3’，anti-sense：5’-GUCUGAAUCAGUGCCU UGCTT-3’；④SRF-1649：sense：5’-GCCACCAUCAUGACGUCAUTT-3’，anti-sense：5’-AUGACGUCAUGAUGGUGGCTT-3’；⑤陰性對照：sense：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT

-3’，anti-sense：5’-ACGUGACACGUUCGGA GAATT-3’。調(diào)整細(xì)胞密度至次融合狀態(tài)(匯合率70%～80%)，0.2% FBS同步化24 h，按照上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司《RNA產(chǎn)品使用手冊》進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染條件為siRNA∶RNAi-Mate為1∶3。實驗分組：①空白對照組；②轉(zhuǎn)染組：加入針對SRF的siRNA及轉(zhuǎn)染劑siRNA-Mate；③轉(zhuǎn)染對照組：僅加入與轉(zhuǎn)染組等劑量的轉(zhuǎn)染劑siRNA-Mate；④陰性對照組：加入針對陰性對照的siRNA及轉(zhuǎn)染劑siRNA-Mate。

1.2.2 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖:調(diào)整細(xì)胞密度為1×104/孔種植于96孔板，次融合后同步化24 h，按照實驗設(shè)計分組(每組10孔)，48 h后加入10 μl/孔 CCK-8,37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h，酶標(biāo)儀450 nm測定A值，計算抑制率(抑制率=1-試驗組A值/空白對照組A值×100%)。

1.2.3 免疫細(xì)胞化學(xué)染色:按照文獻(xiàn)[3]方法制備細(xì)胞爬片，按實驗設(shè)計分組轉(zhuǎn)染，24 h后4%多聚甲醛固定1 h。采用枸鹽酸高壓修復(fù)，一抗過夜(SRF稀釋濃度為1∶100)，按照SABC免疫組化試劑盒說明書進(jìn)行，DAB顯色，蘇木素輕度復(fù)染，中性樹膠封片。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期:按實驗設(shè)計分組并誘導(dǎo)，48 h后，制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度至1×106/ml。70%乙醇44℃固定過夜，離心棄上清，PBS漂洗3次。加入200 μl 1 mg/ml RNA酶37℃處理30 min。加入400 μl 10 mg/ml PI工作液，避光染色30 min，上機檢測。

1.2.5 基質(zhì)膠侵襲實驗檢測侵襲能力收集細(xì)胞:離心重懸調(diào)整細(xì)胞密度為1×105cell/ml，在transwell小室上層加入200 μl單細(xì)胞懸液，下室沿側(cè)壁加入600 μl含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基。37℃，5% CO2培養(yǎng)24 h。取出小室，小心去除濾膜表面未穿膜的腫瘤細(xì)胞。95%乙醇固定，吉姆薩染色。鏡下計數(shù)侵襲細(xì)胞數(shù)，取5個視野的平均值。以侵襲細(xì)胞的相對數(shù)目反映細(xì)胞的侵襲能力。

1.2.6 Western blot檢測蛋白表達(dá):RIPA裂解細(xì)胞，收集上清12 000 g離心15 min，收集上清，分裝冰凍保存。BCA法測定蛋白濃度，按30～50 μg蛋白/泳道上樣并常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)膜，SRF一抗(1∶100)4℃過夜，二抗37℃孵育1 h，加入BCIP/NBT顯色并掃描。采用Image J圖像分析軟件測定條帶的OD值，各組蛋白經(jīng)內(nèi)參平衡后，采用與對照組的比值作為該蛋白的相對表達(dá)量。

1.2.7 Realtime PCR法檢測mRNA的含量:Trizol提取總RNA，SRF、內(nèi)參基因GAPDH引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計合成，分別為SRF：5’-CTTAACATGGCATCTTCGACACT-3’，5’-CTTAACCTC

TAATCCCCATTGCT-3’；GAPDH：5’-GGGAAACTGTGG

CGTGAT-3’,5’-TGGGTGTCGCTGTTGAA GT-3’。反應(yīng)條件：逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(37℃ 15 min，8℃ 5 s)，PCR反應(yīng)(95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30循環(huán))，由RCR儀自帶程序進(jìn)行分析(2-ΔΔCT法)。

2 結(jié)果

2.1 siRNA-SRF對A549細(xì)胞mRNA表達(dá)的影響 Realtime PCR結(jié)果顯示，對肺癌A549給予siRNA-SRF干擾后，4條siRNA均能下調(diào)SRF mRNA的表達(dá)，siRNA-SRF-900、siRNA-SRF-901、siRNA-SRF-1107、siRNA-

SRF-1649分別是對照組的56.4%、36.4%、25.0%和53.6%，相應(yīng)的沉默效率分別為43.6%、63.6%、75.0%和46.3%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=66.042,P<0.05)。轉(zhuǎn)染對照組、陰性對照組表達(dá)水平是空白對照組的94.5%和93.7%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。其中siRNA-SRF-1107基因沉默效率最高，為75.0%。因此選用siRNA-SRF-1107進(jìn)行后續(xù)實驗研究。見表1。

組別SRF mRNA空白對照組1.07±0.09轉(zhuǎn)染對照組1.10±0.14陰性對照組1.07±0.15siRNA-SRF-9000.54±0.07*#△siRNA-SRF-9010.36±0.05*#△siRNA-SRF-11070.25±0.12*#△siRNA-SRF-16490.52±0.04*#△

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與轉(zhuǎn)染對照組比較，#P<0.05；與陰性對照組比較，△P<0.05

2.2 siRNA-SRF對A549細(xì)胞SRF蛋白表達(dá)的影響 SRF定位于肺癌A549細(xì)胞核內(nèi)，予以siRNA-SRF-1107干擾后,SRF染色強度明顯減弱。Western blot檢測顯示，予以siRNA-SRF-1107干擾后，轉(zhuǎn)染組的SRF表達(dá)水平明顯下調(diào)，是空白對照組的40.1%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=142.735,P<0.05)。而陰性對照組和轉(zhuǎn)染對照組表達(dá)水平與空白對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖1、2，表2。

圖1 siRNA對A549細(xì)胞株SRF蛋白表達(dá)的影響(免疫細(xì)胞化學(xué)×200);A 空白對照組；B 陰性轉(zhuǎn)染組；C 轉(zhuǎn)染對照組；D siRNA-SRF轉(zhuǎn)染組

圖2 siRNA對A549細(xì)胞株SRF蛋白表達(dá)的影響(免疫印跡);A 空白對照組；B 陰性轉(zhuǎn)染組；C 轉(zhuǎn)染對照組；D siRNA-SRF轉(zhuǎn)染組

2.3 siRNA-SRF對肺癌A549細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期的影響 轉(zhuǎn)染48 h以后，空白對照組、轉(zhuǎn)染對照組、陰性對照組和轉(zhuǎn)染組的OD值分別為(1.784±0.326)、(1.663±0.141)、(1.738±0.261)和(0.638±0.170)。轉(zhuǎn)染入siRNA-SRF-1107后，A549細(xì)胞株增殖明顯受限，抑制率為64.24%，與空白對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。陰性對照組和轉(zhuǎn)染對照組與空白對照組之間比較，細(xì)胞增殖抑制率分別為2.58%和6.78%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。流式細(xì)胞儀檢測空白對照組、轉(zhuǎn)染對照組、陰性對照組和轉(zhuǎn)染組細(xì)胞周期。各組S期細(xì)胞百分比分別為(44.72±0.60)%、(43.24±2.97)%、(43.73±1.41)%、(23.90±1.94)%?？瞻讓φ战M、陰性對照組和轉(zhuǎn)染對照組在G0/G1、S、G2期百分比方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。而轉(zhuǎn)染siRNA-SRF-1107后，A549細(xì)胞株S期百分比明顯減少(P<0.05)。見表2、3。

組別SRF蛋白表達(dá)水平細(xì)胞增殖空白對照組0.51±0.051.784±0.326轉(zhuǎn)染對照組0.48±0.081.663±0.141陰性對照組0.47±0.151.738±0.261siRNA-SRF-11070.20±0.06*#△0.638±0.170*#△

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與轉(zhuǎn)染對照組比較，#P<0.05；與陰性對照組比較，△P<0.05

組別細(xì)胞周期(S)細(xì)胞侵襲空白對照組44.72±0.60144.83±17.42轉(zhuǎn)染對照組43.24±2.97147.17±12.35陰性對照組43.73±1.41136.83±15.28siRNA-SRF-110723.90±1.94*#△60.50±14.21*#△

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與轉(zhuǎn)染對照組比較，#P<0.05；與陰性對照組比較，△P<0.05

2.4 siRNA-SRF對肺癌A549細(xì)胞侵襲能力的影響 通過transwell小室侵襲實驗，檢測空白對照組、轉(zhuǎn)染組、陰性對照組和轉(zhuǎn)染對照組的細(xì)胞侵襲能力，顯微鏡下計數(shù)侵襲細(xì)胞數(shù)，分別為(144.83±17.42)、(147.17±12.35)、(136.83±15.28)、(60.50±14.21)，與空白對照組比較，siRNA-SRF-1107組侵襲細(xì)胞數(shù)明顯減少(P<0.05)，而陰性對照組和轉(zhuǎn)染對照組與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

3 討論

體內(nèi)研究多發(fā)現(xiàn)，SRF的高表達(dá)與E-cadherin、β-catenin的缺失(異位)表達(dá)密切相關(guān)[4,5]，亦與基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、-9表達(dá)上調(diào)有關(guān)[6]，且與腫瘤預(yù)后相關(guān)[7]提示E-cadherin的表達(dá)缺失和β-catenin的異位表達(dá)(從細(xì)胞膜到細(xì)胞核)破壞了細(xì)胞間的連接，同時伴有MMP蛋白表達(dá)的上調(diào)，使細(xì)胞獲得了更高的運動性和侵襲性，這可能是SRF促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲的機制之一。體外研究則發(fā)現(xiàn)采用過表達(dá)技術(shù)上調(diào)肝癌細(xì)胞株SRF的表達(dá)，能夠使細(xì)胞獲得間質(zhì)細(xì)胞表型，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，而基因沉默SRF則引起相反效應(yīng)，細(xì)胞增殖受抑，細(xì)胞數(shù)量和活力減少，S期細(xì)胞百分比下調(diào)，同時細(xì)胞遷移和侵襲能力下降；采用SRF沉默能產(chǎn)生類似的效果[8-10]。在前列腺癌細(xì)胞中，SRF是雄激素受體的重要決定簇，缺少SRF將會抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖[11,12]。而近年來的文獻(xiàn)也提示，抑制SRF的轉(zhuǎn)錄能夠有效抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[13-15]，提示針對SRF的基因沉默能夠有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移。

本研究選擇了沉默效果最高的siRNA-SRF-1107，有效的下調(diào)SRF在肺癌A549mRNA和蛋白的表達(dá)水平。利用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖明顯受抑，而陰性對照組和轉(zhuǎn)染試劑對照組對細(xì)胞增殖無影響，進(jìn)一步提示設(shè)計的siRNA特異性和靶向性強，采用的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法對細(xì)胞增殖無影響。同時使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染組細(xì)胞被阻滯在G1期，提示SRF可能在A549細(xì)胞株中調(diào)控細(xì)胞周期，與肺癌細(xì)胞增殖密切相關(guān)。進(jìn)一步檢測細(xì)胞侵襲能力發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染的細(xì)胞侵襲能力明顯下降，提示SRF mRNA和蛋白水平的下調(diào)能夠減少肺癌A549細(xì)胞的侵襲能力。

綜上所述，結(jié)合前期在體內(nèi)實驗結(jié)果，本研究提示基因沉默SRF，能夠抑制肺癌A549的增殖，并降低其侵襲能力，SRF可能是防治肺癌治療的一個有效靶點。