白 雪，楊曉敏

1.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院研究生院，內(nèi)蒙古 包頭 014040；2.包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古 包頭 014030

原代心肌細(xì)胞的培養(yǎng)目前已成為心血管疾病基礎(chǔ)研究的必要條件之一，根據(jù)研究目的在體外模擬疾病狀態(tài)下心臟所處的環(huán)境，可建立各種心肌細(xì)胞的病理模型，以便更好地從細(xì)胞和分子水平等研究心血管疾病的發(fā)病機(jī)制。早在 1960 年，科學(xué)家 Harary 和 Farley［1］培養(yǎng)出了 Wister乳鼠心肌細(xì)胞，并提出了乳鼠原代心肌細(xì)胞的培養(yǎng)方法，然而這一傳統(tǒng)方法所分離的心肌細(xì)胞存活率以及純度低、細(xì)胞活性比較差等原因，不能滿足基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究的需求。1976年，科學(xué)家提出了成熟心室肌的培養(yǎng)方法，并在1977年由Jacobson成功培養(yǎng)出了心室肌細(xì)胞。到目前為止，原代心肌細(xì)胞的體外培養(yǎng)技術(shù)日漸成熟，所用的心肌細(xì)胞培養(yǎng)大多是在傳統(tǒng)方法基礎(chǔ)上進(jìn)行改良，分別為單一酶消化法［2-3］和膠原酶與胰酶聯(lián)合使用消化法［4-6］兩種。但兩種方法各有不足之處，為了培養(yǎng)出純度高、存活率強(qiáng)能夠滿足實(shí)驗(yàn)需求的心肌細(xì)胞，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室的條件以及環(huán)境在傳統(tǒng)的方法上進(jìn)行了改進(jìn)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

取新生1～3 d的wistar大鼠，清潔級(jí)，雌雄不限，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，許可證號(hào)scxk（京）2014-0004。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及主要儀器

Ⅱ型膠原酶（Gibco，1797342），低糖型DMEM（Gibco），胎牛血清（Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS，四季青），青鏈霉素雙抗（HyClone），D-（+）-Glucose（Sigma），磷酸鹽緩沖液（PBS），5-溴脫氧尿嘧啶核苷（5-Brdu，Sigma），4%多聚甲醛（博士德生物），α-actin 抗體兔來源（博士德生物），二氨基聯(lián)苯胺（3，3'-diaminobenzidine，DAB）顯色試劑盒，SABC（鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物法）免疫組化試劑盒，二甲苯，TritonX-100（生工生物工程有限公司），37℃恒溫水浴鍋，磁力攪拌器，酶標(biāo)儀（BIO-RAD），CO2培養(yǎng)箱（Thremo），醫(yī)用超凈工作臺(tái)，熒光倒置顯微鏡（OLYMPUS-IX71），多功能臺(tái)式高速離心機(jī)（Eppendorf，5804R0）等。

1.3 原代心肌細(xì)胞的培養(yǎng)

（1）準(zhǔn)備3 個(gè)直徑為60 mm 的培養(yǎng)皿加入10 ml 含雙抗無血清的 DMEM 擠血用。（2） 取出生 1～3 d 的 wistar 乳鼠6只，頸部脫臼處死后，用75%酒精消毒兩次，左手捏住頸部皮膚，右手持眼科剪沿胸骨中線剪開，左手輕輕擠壓，右手持眼科鑷輕輕將心臟取出即刻放入培養(yǎng)皿中，依次在第一、第二個(gè)培養(yǎng)基中輕輕擠壓心臟排出積血，之后鈍性分離心室心尖部位置，剪去心蒂部1/3～1/2，暫存于第三個(gè)平皿中。（3）將所有的心臟放入高壓滅菌后的小燒杯中，加入1 ml 膠原酶。用眼科剪將所有心臟剪成0.5～1 mm3的大小的小塊，再次加入2 ml 的膠原酶消化液，輕輕晃動(dòng)小燒杯5～8次后棄去消化液。（4）再次加入3 ml膠原酶消化液，并用玻璃彎頭吸管將心臟組織與消化液一同準(zhǔn)入100 ml 的血清培養(yǎng)瓶中，放置于37℃恒溫水浴鍋中，消化8～10 min，期間輕輕晃動(dòng)血清瓶，隨后棄去消化液。（5）在培養(yǎng)瓶中再次加入3 ml 膠原酶消化液，繼續(xù)消化10 min，期間每隔2 min輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶60 s，將消化好的液體吸出加入事先準(zhǔn)備好的兩只50 ml 離心管中，離心管中提前加入18 ml 已溫育好的含10%FBS 的低糖DMEM，均勻終止消化，重復(fù)以上步驟10次，直至組織被消化為白色絮狀物為止。（6）收集10 次消化好的細(xì)胞800 r/min 離心5 min，棄掉上清后，每支離心管加入溫育好的10%FBS的DMEM 6ml，重懸細(xì)胞混勻后經(jīng)300 目濾網(wǎng)過濾，濾液加入到一次性培養(yǎng)瓶中，放于37℃培養(yǎng)箱中差速貼壁90 min。（7）取出培養(yǎng)瓶，輕輕晃動(dòng)，用彎頭吸管輕輕吸取上層懸液于15 ml離心管中混勻后，鋪于帶有爬片的24孔板中，每孔1 ml細(xì)胞液并加入終濃度為0.1 mmol/L的Brdu溶液10 ul，抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)。24 h 后換10%FBS 的DMEM液體。

1.4 原代心肌細(xì)胞免疫組化鑒定

免疫組化采用橫紋肌肌動(dòng)蛋白（α-actin），兔來源抗體。細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，將爬片取出，1×PBS洗去殘留的血清及培養(yǎng)基。用預(yù)冷的4%多聚甲醛固定20 min。1×PBS漂洗，0.1%的Triton x-100 通透15 min，后經(jīng)內(nèi)源性過氧化物酶滅活，5%BSA液封閉，一抗以1∶100孵育，濕盒4℃過夜后加羊來源的二抗孵育，最后DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，封片后顯微鏡拍照。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組

正常細(xì)胞在含 10%FBS 的 DMEM 中培養(yǎng) 48～72 h 后，細(xì)胞換液為含1%FBS 的DMEM 饑餓24 h，然后設(shè)置不同糖濃度組，實(shí)驗(yàn)分為6組，分別為對(duì)照組基礎(chǔ)培養(yǎng)基（含糖5.5 mmol/L），高糖組20 mmol/L，33 mmol/L，40 mmol/L，50 mmol/L，60 mmol/L。

1.6 倒置顯微鏡觀察心肌細(xì)胞搏動(dòng)頻率與節(jié)律

記錄高糖作用20 h、48 h、72 h后的心肌細(xì)胞在1 min內(nèi)的搏動(dòng)次數(shù)，同一糖濃度的不同視野中選取5個(gè)細(xì)胞計(jì)數(shù)搏動(dòng)頻率。

1.7 MTT檢測(cè)不同組的細(xì)胞存活率

將消化好的原代心肌細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)范圍在105～106，細(xì)胞稀釋后每孔加200 ul，最終保證每孔的有效細(xì)胞數(shù)為102～104之間?？瞻渍{(diào)零孔只加不含細(xì)胞的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)分組處理后（每組設(shè)置三個(gè)復(fù)孔），每個(gè)孔中加入5 g/L的MTT溶液20 ul，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，小心吸去孔中所有液體，吸干凈后，加入150 ulDMSO，室溫?fù)u床搖10 min，使結(jié)晶充分溶解，酶標(biāo)儀測(cè)490 nm 處吸光度（OD）值。計(jì)算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率=（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值/對(duì)照組OD值-空白組OD值）×100%。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用單因素方差One way-ANOVA分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)

消化好的心肌細(xì)胞鏡下為亮圓形；培養(yǎng)12 h后開始貼壁，部分細(xì)胞伸出偽足，形態(tài)以圓形和三角形多見；18 h小時(shí)后開始出現(xiàn)搏動(dòng)，24 h后已基本貼壁；培養(yǎng)48 h后細(xì)胞搏動(dòng)明顯，平均搏動(dòng)（85±7）次/min，呈典型的梭型狀，也有細(xì)胞呈團(tuán)簇狀生長(zhǎng)，立體感十分明顯，收縮強(qiáng)勁有力，成纖維細(xì)胞無立體感。培養(yǎng)5 d 后，細(xì)胞成團(tuán)狀搏動(dòng)頻率一致，見圖1。

圖1 原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)48 h后形態(tài)圖

2.2 心肌細(xì)胞免疫組化鑒定

免疫組化鑒定心肌細(xì)胞a-actin 表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞呈現(xiàn)棕色，如圖2a，圖2b 陽(yáng)性率在95%以上，而成纖維細(xì)胞則不表達(dá)，如圖2c中箭頭所指，見圖2。

圖2 心肌細(xì)胞與成纖維細(xì)胞免疫組化鑒定

2.3 糖對(duì)心肌細(xì)胞搏動(dòng)次數(shù)的影響

高糖作用20 h 時(shí)，糖濃度為40 mmol/L、50 mmol/L、60 mmol/L 的心肌每分鐘搏動(dòng)次數(shù)明顯加快，為（153±7）次/min，（138 ± 7）次/min，（113 ± 5）次/min 與 對(duì) 照 組5.5 mmol/L（36±5）次/min 的糖濃度相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；高糖作用48 h 時(shí)，糖濃度為40 mmol/L、50 mmol/L、60 mmol/L 組心肌搏動(dòng)次數(shù)顯著下降，分別為（40±4）次/min，（50±3）次/min，（40±4）次/min與對(duì)照組（109±3）次/min 相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），高糖作用48 h糖濃度為20 mmol/L和33 mmol/L兩組、40 mmol/L 和60 mmol/L 兩組之間細(xì)胞搏動(dòng)次數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；高糖作用72 h 后，與對(duì)照組5.5 mmol/L 糖濃度相比，實(shí)驗(yàn)組心肌搏動(dòng)次數(shù)明顯低于對(duì)照組（P＜0.05），且搏動(dòng)頻率不一致、不規(guī)律，表現(xiàn)為異常自律性，見圖3。

2.4 各組細(xì)胞MTT結(jié)果

分組后培養(yǎng)48 h，與對(duì)照組相比，高糖組20 mmol/L、33 mmol/L、40 mmol/L、50 mmol/L、60 mmol/LOD 值逐漸下降（P＜0.01），細(xì)胞存活率明顯降低（P＜0.05），以50 mmol/L和60 mmol/L下降最明顯，分別為（50.5%±4.7）和（48.7%±9.8），見圖4。

3 討論

圖3 不同濃度糖作用20 h、48 h、72 h后心肌細(xì)胞每分鐘搏動(dòng)次數(shù)

圖4 高糖作用48 h后心肌細(xì)胞存活率

原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)作為心血管疾病發(fā)生的分子機(jī)制研究發(fā)揮著不可替代的作用，在排除神經(jīng)、體液等因素的影響，保持完整的心肌的結(jié)構(gòu)與功能觀察藥物或者毒物對(duì)心肌的作用影響等，是一項(xiàng)重要的體外基礎(chǔ)試驗(yàn)。高效率的培養(yǎng)方法是實(shí)驗(yàn)開展的基礎(chǔ)條件。對(duì)于乳鼠的選擇，我們認(rèn)為成年的大鼠心臟不具備分裂增殖能力，屬于終末分化細(xì)胞［7］，大鼠出生年齡越短其心肌細(xì)胞分離后的存活能力越強(qiáng)，越容易貼壁生長(zhǎng)，因此選擇大鼠新生1～2 d 的乳鼠分離心臟培養(yǎng)心肌細(xì)胞。同時(shí)要選擇具有正常生育周期、哺乳周期的大鼠，這樣才可以繁殖出狀態(tài)最好的乳鼠。對(duì)于實(shí)驗(yàn)?zāi)z原酶的選擇，我們選用Ⅱ型膠原酶，配制成0.06%的濃度消化，其作用溫和短時(shí)多次消化可以消化完全，增加細(xì)胞產(chǎn)量，同時(shí)做到對(duì)細(xì)胞最小的損傷。實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵點(diǎn)之一即做到無菌操作，所有用到的器械、培養(yǎng)瓶、燒杯都要經(jīng)過高壓滅菌，紫外照射除菌。

本實(shí)驗(yàn)探討了不同糖濃度的培養(yǎng)基對(duì)原代心肌細(xì)胞增殖的影響，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)48～72 h 之后，細(xì)胞跳動(dòng)次數(shù)達(dá)80次/min，換成低營(yíng)養(yǎng)的培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)24 h后，分為不同糖濃度組，繼續(xù)培養(yǎng)的20 h、48 h、72 h后，細(xì)胞的跳動(dòng)具有明顯差異，尤以40 mmol/L、50 mmol/L、60 mmol/L表現(xiàn)最明顯，這三組在分組后的20 h之內(nèi)搏動(dòng)頻率快速增加，到20 h達(dá)到峰值，之后一直到72 h搏動(dòng)頻率快速下降，且在48 h之后心肌搏動(dòng)不規(guī)律，表現(xiàn)為異常的自律性。而對(duì)照組即用基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞隨著時(shí)間延長(zhǎng)，搏動(dòng)次數(shù)逐漸增加最后趨于穩(wěn)定，心肌搏動(dòng)頻率一致，活力較高糖組好。MTT 檢測(cè)細(xì)胞存活率，高糖作用48 h 后，設(shè)對(duì)照組細(xì)胞存活率為100%，高糖組心肌細(xì)胞存活率與對(duì)照組相比明顯下降，表明高糖抑制細(xì)胞的增殖。高糖環(huán)境對(duì)細(xì)胞的損傷是多方面的，但其具體的機(jī)制目前尚不清楚［8］，可能的原因有高糖的糖毒性增加了心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激、細(xì)胞的凋亡等［9-11］，有研究顯示［12］，高糖條件下，c-Src/PI3K/ERK通路表達(dá)失調(diào)是高糖對(duì)細(xì)胞造成損傷的一個(gè)原因。高糖導(dǎo)致的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、晚期糖基化終末產(chǎn)物增加都會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞的損傷，高糖抑制細(xì)胞的增殖導(dǎo)致心肌細(xì)胞搏動(dòng)節(jié)律性改變的具體分子機(jī)制，有待課題組進(jìn)一步探討探究。