劉晶晶，陳志元，王 玉，江 丹，李名潔

（勁牌持正堂藥業(yè)有限公司，湖北黃石 435000）

我國是世界最早開發(fā)利用茶葉的國家，在茶葉的生產(chǎn)與消費(fèi)上位居世界前列[1]。茶葉在生產(chǎn)加工過程中會產(chǎn)生大量的茶末、茶梗等副產(chǎn)品，利用價值不高。隨著茶葉深加工行業(yè)的發(fā)展，茶葉廢料得到有效利用，特別是對茶末廢料進(jìn)行提取、分離純化，可以獲得多種生物活性物質(zhì)，其中L-茶氨酸因其良好的生理功能與藥用價值，逐漸成為國內(nèi)外天然藥物開發(fā)關(guān)注的熱點(diǎn)[2]。

L-茶氨酸，又名L-谷氨酸-γ-乙基酰胺，是茶葉中特有的氨基酸，占茶葉干質(zhì)量的0.5%～3.0%，天然存在的L-茶氨酸均為L型，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定[3]，具有降低血壓、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞、抑制癌細(xì)胞、浸潤、減肥、改善經(jīng)期綜合癥、提高免疫力、防御病毒等作用[4]。研究表明，茶葉中L-茶氨酸的含量與茶葉的品質(zhì)呈正相關(guān)，茶葉中酚氨比值低，有利于茶葉品質(zhì)[5]?，F(xiàn)有的L-茶氨酸獲取方式有化學(xué)合成法、微生物發(fā)酵法、茶葉愈傷組織及細(xì)胞培養(yǎng)法、體外酶促合成法等，存在安全性、成本高、技術(shù)難點(diǎn)攻克等問題[6-7]。從茶葉中直接提取分離制備獲得L-茶氨酸，操作簡便，易于實(shí)現(xiàn)。L-茶氨酸是兩性電解質(zhì)，使用離子交換樹脂通過離子交換反應(yīng)，可以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物質(zhì)與雜質(zhì)的分離[8]。

以綠茶末為原料，在實(shí)驗(yàn)室前期確定了提取、大孔吸附除雜工藝的基礎(chǔ)上，分別比較了LSI-010（H+），LSI-010（NH4+），001×7（NH4+），D941（OH-）4種類型離子交換樹脂對綠茶末L-茶氨酸的純化效果，并確定了LSI-010（H+）最佳上樣pH值和氨水洗脫濃度。

1 材料與儀器

1.1 儀器

Waters e2695型高效液相色譜儀；AB135-S型分析天平，梅特勒-托利多公司產(chǎn)品；Sepax C18型色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），安捷倫科技公司產(chǎn)品；ELGA Option-Q型超純水系統(tǒng)；水浴鍋，上海申生科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 試藥

綠茶末，購自湖北宜昌；LSI-010型樹脂，西安藍(lán)深科技有限公司提供；001×7樹脂、D941樹脂，西安藍(lán)曉科技有限公司提供；對照品L-茶氨酸（純度98%，批號DST170621-021），成都德斯特生物技術(shù)有限公司提供；乙腈（TEDIA，色譜純）；鹽酸、氨水、氫氧化鈉，均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供。

2 L-茶氨酸檢測方法

2.1 對照品儲備液的制備

精密稱取L-茶氨酸對照品11.78 mg于50 mL容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，即為對照品儲備液，L-茶氨酸濃度為230.89 mol/L。

2.2 供試品溶液制備

精密稱取綠茶末提取物50.00 mg于10 mL容量瓶，加水超聲溶解，定容至刻度，搖勻，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，即為供試品溶液。

2.3 色譜條件

色譜柱：Sepax C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；紫外檢測器，檢測波長為210 nm；按照表1梯度洗脫，流動相流速0.5 mL/min，柱溫30℃。

梯度洗脫見表1，L-茶氨酸對照品HPLC色譜圖見圖1，綠茶末提取物HPLC色譜圖見圖2。

表1 梯度洗脫

圖1 L-茶氨酸對照品HPLC色譜圖

圖2 綠茶末提取物HPLC色譜圖

2.4 檢測方法學(xué)研究

2.4.1 線性范圍考查

分別精密移取2.1項(xiàng)下對照品儲備液2，4，6，8，10 mL于10 mL容量瓶，加水稀釋定容，所得L-茶氨酸濃度分別為46.18，92.36，138.53，184.71，230.89 mol/L，0.22 μm濾膜濾過后，作為標(biāo)準(zhǔn)品溶液備用。按照2.3項(xiàng)下所示條件進(jìn)行色譜分析，以L-茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度為橫坐標(biāo)（X），以L-茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液峰面積為縱坐標(biāo)（Y），建立標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=9.02×103X-1.81×104，R=0.999 5。

2.4.2 精密度試驗(yàn)

精密稱取綠茶末提取物51.31 mg，按照2.2中所示方法制備供試品溶液，在2.3項(xiàng)下進(jìn)行色譜分析連續(xù)進(jìn)樣6次，精密度試驗(yàn)RSD值為0.87%。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取2.4.2中的供試品溶液，按照2.3中色譜條件下分別于0，40，80，120，240 min時進(jìn)樣分析，得到綠茶末提取物中L-茶氨酸的峰面積，穩(wěn)定性試驗(yàn)RSD值為0.94%。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取綠茶末提取物50 mg共6份，按照2.2中所示方法制備供試品溶液，按照2.3中條件進(jìn)行色譜分析，利用建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各供試品溶液中L-茶氨酸的含量，重復(fù)性試驗(yàn)RSD值為0.94%。

2.4.5 加標(biāo)回收試驗(yàn)

精密稱取綠茶末提取物25 mg共9份，分別加入相當(dāng)于25 mg提取物中L-茶氨酸含量50%，100%，150%3個梯度的L-茶氨酸對照品溶液各3份，按照2.2中所示方法制備綠茶末提取物供試品溶液作為加標(biāo)回收試驗(yàn)樣品，按照2.3中條件進(jìn)行色譜分析，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算L-茶氨酸的含量及回收率。計算所得綠茶末提取物中L-茶氨酸的平均回收率為102.82%，加標(biāo)回收試驗(yàn)的RSD值為0.02%。

3 離子交換樹脂對L-茶氨酸純化效果的考查

綠茶末經(jīng)混勻后，分別加入藥材量15倍，10倍純化水，于70℃下提取30 min，提取2次，過濾后，經(jīng)大孔樹脂吸附分離，收集上樣流出水洗液，分別考查離子交換樹脂類型、上樣pH值和氨水洗脫濃度對L-茶氨酸純化效果的影響。

3.1 不同類型離子交換樹脂對L-茶氨酸純化效果的影響

稱取等量綠茶末4份，經(jīng)過提取、大孔樹脂分離后，收集上樣流出水洗液，分別經(jīng)LSI-010（H+），LSI-010（NH4+）、001×7（NH4+）、D941（OH-）樹脂交換后，4 BV水洗，棄去水洗液，0.5 mol/L氨水6 BV洗脫，收集洗脫液，濃縮干燥，計算收率，并測定L-茶氨酸的含量。

不同類型離子交換樹脂對L-茶氨酸的純化效果見表2。

3.2 不同上樣pH值對L-茶氨酸純化效果的影響

表2 不同類型離子交換樹脂對L-茶氨酸的純化效果

精密稱取等量LSI-010共5份，預(yù)處理為H型后濾干水分，4%HCl調(diào)節(jié)大孔水洗流出液pH值為3.0～3.5，3.5～4.0，4.0～4.5，4.5～5.0，5.0～5.5，加樣至離心管中，靜態(tài)吸附，間歇振蕩混勻，測定吸附前后L-茶氨酸濃度，計算L-茶氨酸的吸附率。

式中：C0——吸附前L-茶氨酸的量，mg；

C1——吸附后L-茶氨酸的量，mg。

不同上樣pH值對L-茶氨酸的純化效果見表3。

表3 不同上樣pH值對L-茶氨酸的純化效果

3.3 不同濃度氨水洗脫對L-茶氨酸純化效果的影響

稱取等量LSI-010共5份，預(yù)處理為H型后，裝柱上樣，4 BV水洗，棄去水洗液，分別以6 BV 0.25，0.50，1.00，1.50，2.0 mol/L氨水洗脫，收集洗脫液，濃縮干燥，測定提取物中L-茶氨酸含量。

不同濃度氨水洗脫對L-茶氨酸的純化見表4。

表4 不同濃度氨水洗脫對L-茶氨酸的純化

4 結(jié)論

不同類型離子交換樹脂對L-茶氨酸的純化效果（表2）結(jié)果顯示，經(jīng)4種樹脂交換后，綠茶末提取物中L-茶氨酸的含量從高到低依次為LSI-010（H+），LSI-010（NH4+），001×7（NH4+），D941（OH-），提取物的收率從高到低依次為D941（OH-），001×7（NH4+），LSI-010（H+），LSI-010（NH4+）；L-茶氨酸是兩性電解質(zhì)，其水溶液顯示弱酸性，在此狀態(tài)下，L-茶氨酸以陽離子形式存在，因而可以與陽離子樹脂發(fā)生交換。由于不同類型離子交換樹脂的交換基團(tuán)選擇性和交聯(lián)度的差異，其對L-茶氨酸的吸附和交換能力也各不相同；樹脂轉(zhuǎn)型后對L-茶氨酸的吸附影響很大，就試驗(yàn)結(jié)果而言，H+比NH4+交換能力強(qiáng)[9]。

不同上樣pH值對L-茶氨酸純化效果（表3）結(jié)果顯示，當(dāng)pH值在4.5～5.0時，LSI-010（H+）對L-茶氨酸的吸附率較高；降低pH值，相應(yīng)增加了體系的離子強(qiáng)度，但溶液中的離子與L-茶氨酸存在競爭交換基團(tuán)?？紤]到生產(chǎn)中酸液易于腐蝕管道與設(shè)備，調(diào)節(jié)pH值對L-茶氨酸純化差異不大，為了避免增加工藝的復(fù)雜性，因而LSI-010（H+）上樣前無需調(diào)節(jié)pH值（5.0～5.5）。

不同氨水濃度對L-茶氨酸的純化效果（表4）結(jié)果顯示，隨著氨水洗脫濃度的增加，提取物中L-茶氨酸的含量先增加后下降，在氨水濃度為0.50 mol/L時，提取物中L-茶氨酸的含量最高；當(dāng)氨水濃度增加，洗脫液的離子強(qiáng)度也相應(yīng)增加，L-茶氨酸被釋放和置換速度更快，但隨之更多的雜質(zhì)也被洗脫下來。