馬建民 ， 張凡建 ， 段素云

(北京農業(yè)職業(yè)學院 ， 北京 房山 102442)

牛至(OriganumvulgareL.)為唇形科牛至屬多年生草本植物，分布廣泛。本品性涼，味辛，無毒，具有清熱解表、利水消腫的功效。主治中暑、感冒、頭痛身痛、急性胃腸炎、腹痛吐瀉、水腫等癥[1]。牛至也是被廣泛研究的植物添加劑[2-4]，具有很大潛力成為抗生素的天然替代品，其主要抗菌成分為香芹酚(Carvacrol)和麝香草酚(Thymol)。本試驗建立了牛至有效成分香芹酚和麝香草酚的高效液相色譜分析法，并對不同產地牛至進行了檢測，為今后牛至的產地選擇提供基礎研究數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備 高效液相色譜儀(島津LC-16AT)、電子分析天平[賽多利斯科學儀器(北京)有限公司SQP]、昆山KQ-500DV超聲清洗機、震蕩器(IKA)、微量移液器等。

1.2 試劑 香芹酚對照品、麝香草酚對照品(>99.0%，Macklin公司)；甲醇、乙腈(色譜純，F(xiàn)isher Scientific公司)；水為超純水；牛至1，產地廣西，購自菩提藥源；牛至2，產地河北，購自誠信正品藥業(yè)；牛至3，產地浙江，購自藥都保健養(yǎng)生堂；牛至4，產地河南，購自福衛(wèi)冷背藥材行。

1.3 溶液配制

1.3.1 標準儲備液 分別稱取香芹酚和麝香草酚對照品0.020 0 g，用甲醇定容至10 mL，制得終濃度為2 mg/mL的2種標準儲備液。

1.3.2 混合標準工作液 取以上2種標準儲備液，用甲醇稀釋制備2、10、20、50、100 μg/mL 5 個系列濃度的混合標準工作液，存放于4 ℃冰箱。

1.4 色譜條件 色譜柱InertSustain C18(150 mm×2.1 mm，3 μm)；紫外檢測波長276 nm；流動相為乙腈-水(40∶60)；柱溫50 ℃；流速0.4 mL/min；進樣量10 μL。

1.5 牛至預處理 牛至粉碎，過4號篩，稱取1.000 0 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理(功率100 W，頻率40 kHz)40 min， 放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，上清液用微孔濾膜(0.25 μm)濾過后上機檢測。

1.6 標準曲線及線性范圍 取上述混合標準工作液，按1.4色譜條件從低濃度到高濃度測定，將測得香芹酚和麝香草酚的色譜峰面積(A)和相對應的濃度(C)做直線回歸，求得標準曲線回歸方程的線性范圍和相關系數(shù)。

1.7 檢測限及定量限 以信噪比(S/N≥10)作為定量限，以信噪比(S/N≥3)作為檢測限。按1.6中所得標準曲線計算香芹酚和麝香草酚檢測限及定量限。

1.8 精密度和準確度 不同產地牛至，按1.5中牛至預處理方法，做5 個平行樣品，按1.4中色譜條件分析，計算樣品標準差。不同產地牛至，稱取牛至粉1.000 0 g，置具塞錐形瓶中，分別精密加入香芹酚和麝香草酚標準儲備液0.1 mL，從1.5中牛至預處理方法，精密加甲醇開始進行預處理，按1.4中色譜條件分析，計算樣品回收率。

2 結果

2.1 色譜圖 混合標準工作液和牛至樣品色譜圖見圖1、2，香芹酚和麝香草酚完全分離，色譜峰形對稱。標準圖譜中香芹酚和麝香草酚，出峰時間分別為10.890 min和12.222 min，保留時間合理。

圖1 混合標準工作液色譜圖

圖2 牛至樣品色譜圖

2.2 方法學考察 按1.6～1.8中方法，香芹酚和麝香草酚的標準曲線和線性范圍、檢測限和定量限、準確度和精密度見表1。線性關系良好，標準差和回收率符合要求。

表1 方法學考察

2.3 不同產地牛至中香芹酚和麝香草酚的含量 購買4 個產地牛至藥材中香芹酚和麝香草酚的含量見表2。河北產牛至中香芹酚含量最高，為0.61 mg/g；廣西產牛至中麝香草酚含量最高，為1.08 mg/g。

3 討論

3.1 牛至預處理 廣西牛至樣品分別用超聲15、30、45、60 min處理，含量測定結果見圖3，由圖3可知，本試驗確定超聲時間為45 min。

3.2 流動相選擇 香芹酚與麝香草酚為同分異構體，其化學名稱分別為2-甲基-5-異丙基苯酚和 5-甲基-2-異丙基酚，完全分離困難。研究發(fā)現(xiàn)，當流動相為甲醇-水時，甲醇比例過高，香芹酚和麝香草酚達不到完全分離，降低甲醇比例，出峰時間延長。香芹酚和麝香草酚在乙腈-水的流動相中更易分離。本試驗采用乙腈-水(40∶60) 進行色譜分析，分離度良好，出峰時間合適。

3.3 不同產地牛至比較 香芹酚和麝香草酚是牛至抗菌作用的有效成分，所以選定香芹酚和麝香草酚為評價牛至質量的檢測指標。4 個產地牛至中香芹酚和麝香草酚含量范圍在0.24～0.61、0.28～1.08 mg/g。河北產牛至中香芹酚含量極顯著高于其他地區(qū)。廣西產牛至中麝香草酚含量顯著高于浙江，極顯著高于其他地區(qū)。以香芹酚和麝香草酚含量為判斷依據(jù)，初步認為廣西最佳，浙江次之，河南較差。劉紅兵等[5]對不同產地牛至香芹酚和麝香草酚含量進行檢測，香芹酚含量范圍是0.1～2.9 mg/g，麝香草酚含量范圍是0.1～6.3 mg/g?？梢姴煌a地牛至中香芹酚和麝香草酚含量，存在較大的差異,說明牛至的資源品質層次不齊。開展牛至藥效研究時，首先要確保牛至產地，否則會出現(xiàn)不一致的試驗結果。在使用牛至作為添加劑，可測定香芹酚和麝香草酚含量來調整添加劑量。同時應開展牛至樣品的標準化生產規(guī)范研制，確保牛至原料質量穩(wěn)定。