王安平 ， 彭侃霖 ， 肖 鵬 ， 彭瑞妮 ， 李國生 ， 鄭文亞,2,3

(1. 宜春學(xué)院生命科學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院 ， 江西 宜春 336000 ; 2. 江西省高等學(xué)校硒農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心 ， 江西 宜春 336000 ; 3. 江西綠科農(nóng)牧科技有限公司 ， 江西 宜春 336000)

隨著國內(nèi)集約化養(yǎng)殖程度不斷提高，畜禽的長途運輸十分常見，而運輸本身是一種應(yīng)激壓力[1]。運輸涉及到動物隔離、活動受限、身體失衡、環(huán)境溫度和濕度的波動、飼料和水的缺乏以及其他應(yīng)激誘導(dǎo)因素[2]。這些因素共同作用在畜禽上，誘導(dǎo)動物產(chǎn)生應(yīng)激，對畜禽的免疫、呼吸、消化和神經(jīng)等系統(tǒng)產(chǎn)生不良影響，降低畜禽的經(jīng)濟(jì)價值，給養(yǎng)殖場造成經(jīng)濟(jì)損失。

白細(xì)胞介素-2(IL-2)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)是由Th1細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，二者都為促炎因子；白細(xì)胞介素-4(IL-4)和白細(xì)胞介素-6(IL-6)是由Th2細(xì)胞合成的細(xì)胞因子，IL-4有抗炎作用，而IL-6是具有促炎和抗炎雙重作用的細(xì)胞因子[4]； 熱休克蛋白70(HSP70)參與細(xì)胞的應(yīng)激保護(hù)，在應(yīng)激條件下表達(dá)會增加，具有調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的作用。本試驗以小鼠為實驗動物，模擬運輸應(yīng)激對脾臟的影響，探究熱休克蛋白(HSP70)、白細(xì)胞介素(IL-2、IL-4和IL-6)和腫瘤壞死因子(TNF-α)水平的變化與運輸之間的關(guān)聯(lián)，并篩選出可能的應(yīng)激評判分子指標(biāo)，為降低畜禽運輸應(yīng)激提供有價值的參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選用清潔級雄性8～9周齡ICR小鼠30只，體重(30±5)g，購自湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司。飼養(yǎng)環(huán)境溫度(23±1)℃，采食和飲水自由。適應(yīng)性飼喂10 d后進(jìn)行試驗。

1.2 主要儀器及試劑 小鼠IL-2、IL-4、IL-6、HSP-70、TNF-α酶聯(lián)免疫分析試劑盒，均購自青島生物科技有限公司。飛鴿牌低速臺式離心機(jī)(型號：TDL-60B)，購自上海安亭科學(xué)儀器廠；美國酶標(biāo)讀數(shù)儀(型號：Awareness Chromate 4300)和超低溫冰箱(ThermoScientific)，均購自江西省立康科技有限公司；微量振蕩器(型號：MH-2)，購自海門市其林貝爾儀器制造有限公司；恒溫培養(yǎng)震蕩器(型號：ZWY-211C)，購自上海智城分析儀器制造有限公司。

1.3 試驗設(shè)計 將30只小鼠隨機(jī)均分成3組，對照組、處理組1和處理組2，對照組不處理，將處理組1和處理組2的小鼠分裝至有蓋鼠籠中，放入恒溫培養(yǎng)震蕩器中，在35 ℃、160 r/min條件下分別持續(xù)處理2 h和6 h。處理結(jié)束后立即處死，無菌摘取脾臟放入液氮速凍，然后放入-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 檢測指標(biāo)及方法 細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IL-6 和TNF-α以及HSP70含量均采用雙抗夾心法,參照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行檢測，用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定吸光度(OD值)，以標(biāo)準(zhǔn)品的OD值為橫坐標(biāo)，濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并得出線性回歸方程，根據(jù)脾臟樣品測得的OD值，計算出細(xì)胞因子和HSP70的含量。

1.5 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析，試驗數(shù)據(jù)均以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，P<0.05為差異顯著，P>0.05為差異不顯著；對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行LSD多重比較，同一行中小寫字母標(biāo)記相同的組之間表示差異不顯著(P>0.05)；同一行中小寫字母標(biāo)記不同的組之間則表示差異顯著(P<0.05)

2 結(jié)果

應(yīng)激后小鼠出現(xiàn)明顯的運輸應(yīng)激臨床癥狀，如不安、狂躁、顫抖，被毛雜亂等。通過檢測細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IL-6 和TNF-α以及HSP70含量，結(jié)果顯示，與對照組相比，處理組1和處理組2的IL-2含量均有升高趨勢，但差異均不顯著(P>0.05)；處理組1的IL-4含量與對照組相比顯著降低(P<0.05)，處理組2的含量下降，但無顯著差異(P=0.083)；處理組1、2與對照組之間IL-6和HSP70含量均無顯著差異(P>0.05)；處理組1與對照組相比TNF-α含量有升高趨勢，但差異不顯著(P>0.05)，處理組2的含量則顯著升高(P<0.05)。見表1。

表1 小鼠脾臟IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α和HSP70的水平

3 討論

本試驗以小鼠為對象，模擬了實際運輸過程中應(yīng)激源對動物生理狀態(tài)的影響。試驗結(jié)果顯示，模擬運輸后，小鼠出現(xiàn)明顯的臨床癥狀，細(xì)胞因子水平發(fā)生了變化，這提示運輸應(yīng)激影響著動物的狀態(tài)。在實際運輸中，應(yīng)激源來源眾多，對機(jī)體的影響較為復(fù)雜，畜禽比如牛可能因此受到多種損傷，尤其是犢牛在應(yīng)激條件下免疫力下降，極易感染多種傳染性疾病[5]。牛呼吸道系統(tǒng)疾病(BRD)是一個復(fù)雜的疾病，其特征是原發(fā)性病毒感染，然后是繼發(fā)性細(xì)菌感染。BRD涉及的病毒有牛病毒性腹瀉病毒、牛呼吸道合胞病毒(BRSV)和皰疹病毒1型(BoHV-1)等[6]。BoHV-1又稱牛傳染性鼻氣管炎病毒，是造成牛經(jīng)濟(jì)損失的重要病毒之一。有研究表明，BRD的發(fā)病機(jī)制是BoHV-1先感染肺部，促炎細(xì)胞因子(IL-2、TNF-α)顯著升高，細(xì)菌隨后侵襲肺部，數(shù)小時內(nèi)發(fā)生膿毒癥，死亡率為30%～70%[7-9]。BRSV的發(fā)病機(jī)制與細(xì)胞因子的不同表達(dá)譜有關(guān)，其抵抗力可能與促炎細(xì)胞因子的表達(dá)水平有關(guān)，尤其是TNF-α、IL-4和IL-6[10]。因此應(yīng)該重視運輸應(yīng)激給畜禽如牛、羊帶來的健康問題，研究細(xì)胞因子與運輸應(yīng)激引起疾病的關(guān)系，為更好的預(yù)防疾病提供可靠依據(jù)。

脾臟是重要的外周免疫器官，有產(chǎn)生淋巴細(xì)胞的功能，觀察應(yīng)激后脾臟細(xì)胞因子表達(dá)的變化及其調(diào)控機(jī)制，可以進(jìn)一步深入闡明運輸應(yīng)激對小鼠免疫功能的影響。本試驗結(jié)果顯示，與對照組相比，運輸應(yīng)激2 h組脾臟組織中IL-4含量顯著降低(P<0.05)， 運輸應(yīng)激6 h組也降低(P=0.083)，而IL-4是輔助體液免疫和抗炎的主要細(xì)胞因子，說明機(jī)體的體液免疫受到一定抑制，且對脾臟可能產(chǎn)生一定的炎性反應(yīng)。司鴻飛[11]的研究表明，從分離出來的淋巴細(xì)胞內(nèi)檢測，架子牛運輸組與不運輸組相比，IL-4濃度極顯著降低，也證實了運輸應(yīng)激對機(jī)體免疫系統(tǒng)的影響。有研究表明，運輸應(yīng)激會導(dǎo)致試驗肉牛血清中促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、IFN-γ、IL-2濃度升高，TNF-α濃度降低[12]。運輸后豬的免疫機(jī)能發(fā)生變化，但運輸應(yīng)激對免疫機(jī)能的影響存在一定的時效性[13]。袁建彬等[14]的研究表明，不同時間的運輸應(yīng)激可導(dǎo)致肝臟和脾臟中HSP70與C反應(yīng)蛋白(CRP)的濃度升高，可作為肉牛運輸應(yīng)激候選診斷標(biāo)志物，說明脾臟對運輸應(yīng)激的影響有一定的標(biāo)志意義。本試驗發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，運輸應(yīng)激6 h組脾臟組織中TNF-α含量顯著升高(P<0.05)， 2 h時其變化并不顯著，說明隨著運輸時間的延長，其對TNF-α含量變化有一定影響，TNF-α在一定的病理狀態(tài)(如慢性炎性疾病)下產(chǎn)生增多，其增高預(yù)示著對正常免疫功能的破壞，且脾臟可能產(chǎn)生了一定的病理變化。

綜上所述，運輸應(yīng)激會導(dǎo)致小鼠脾臟中IL-4含量降低和TNF-α含量升高，其中2 h運輸應(yīng)激導(dǎo)致IL-4含量顯著降低，6 h的運輸應(yīng)激導(dǎo)致TNF-α含量顯著升高，這提示運輸對小鼠免疫功能有影響，脾臟IL-4和TNF-α的水平可以作為小鼠運輸應(yīng)激的候選評判分子指標(biāo)。