楊 珊，韋睿然，陳遠志，楊 旭，王 娟，楊杏芝，何志旭*，丁 驍*

1貴州醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院 免疫學教研室組織工程與干細胞中心，貴陽 550004；2中國科學院昆明植物研究所 植物化學與西部植物資源持續(xù)利用國家重點實驗室，昆明 650201

肝癌是臨床上最常見的惡性腫瘤之一。近年來，肝癌已成為中國發(fā)病率和死亡率較高的癌癥，是全球癌癥死亡的第三大原因[1,2]；肝癌的治療包括外科手術(shù)、介入治療、化學療法和肝移植，但治療效果并不理想[3]。盡管化學療法極大地提高了患者的生存率，但嚴重的毒副作用阻礙了抗癌藥物的治療效果[4]。尋找對腫瘤細胞具有抑制作用的天然小分子化合物，是抗癌藥物發(fā)現(xiàn)的重要來源。

Tagitinin D(圖1)屬于倍半萜內(nèi)酯類天然小分子化合物[5]，在菊科植物中大量存在。Tagitinin D類化合物具有抗腫瘤[6]、細胞毒性[7]、抗炎[8]、抗菌[9]、抗真菌[10]特性。據(jù)報道tagitinin D的類似物tagitinin A和tagitinin C 能減少種子發(fā)芽和幼苗生長[11]；tagitinin C也具有多種生物活性，包括抗癌作用，且tagitinin C衍生物具有作為癌癥治療的巨大潛力[12]。但是對tagitinin D的生物活性研究較少。本論文用人肝癌HepG2細胞為研究對象，探討tagitinin D對肝癌細胞的增殖、凋亡的影響，并檢測ER stress信號通路相關(guān)蛋白的變化，探究其抑制腫瘤的可能機制，為開發(fā)利用其藥用價值提供科學依據(jù)。

圖1 Tagitinin D的化學結(jié)構(gòu)Fig.1 The chemical structure of tagitinin D

1 材料與儀器

1.1 受試細胞株

人肝癌HepG2細胞株由中國科學院昆明植物研究所活性篩選中心孔清華老師惠贈。

1.2 主要試劑

Tagitinin D，購于云南西力生物技術(shù)有限公司，純度99%，碘化丙啶PI、溴化四氮唑藍MTT(Biosharp生物公司)，Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒(四正柏生物)，二甲基亞砜DMSO(天津市風船化學試劑科技有限公司)，高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、雙抗(青霉素10 000 U/mL、鏈霉素10 mg/mL)(GIBCO)，抗體：Actin、PDI、Calnexin、Bip、Ero1-Lα、IRE1α、p-eIF2α(CST)。

1.3 主要儀器

BD FACS Celesta3激光流式細胞儀；成像型微孔板檢測儀(BioTek Cytationl)；全自動化學發(fā)光圖像分析系統(tǒng)(tanon5200)；立式自動壓力蒸汽滅菌器(GR60DR)；1300系列Ⅱ級A2型生物安全柜(Thermo)；SCILOGEX離心機(CF1524R)。

2 實驗方法

2.1 細胞培養(yǎng)

用含10%的FBS(胎牛血清)、1%雙抗(青霉素10 000 U/mL、鏈霉素10 mg/mL)的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HepG2細胞，放置在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，取對數(shù)生長期且細胞狀態(tài)良好的細胞用于后續(xù)實驗。

2.2 檢測人肝癌HepG2細胞活力

采用溴化四氮唑藍(MTT)法檢測細胞活力[13]。取對數(shù)生長期細胞，胰酶消化后吹打呈單細胞懸液將其接種于96孔板，每孔100 μL，待細胞貼壁后，加入不同濃度tagitinin D，每個濃度作4個復孔，置培養(yǎng)箱中72 h，棄上清，每孔中加入100 μL MTT溶液(5 mg/mL),放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清后再加入100 μL DMSO，用多功能酶標儀在波長490 nm處測量各孔的吸光度(OD值)，按下列公式計算細胞活力：

細胞活力=處理組平均OD值/

對照組平均OD值 × 100%

2.3 克隆形成實驗

取對數(shù)生長期細胞胰酶消化后呈單細胞懸液，用細胞計數(shù)板計數(shù)，按300個/mL接種于6孔板中，每孔2 mL，待細胞貼壁后，加入不同濃度的tagitinin D(1和2 μM)，繼續(xù)培養(yǎng)12天，棄培養(yǎng)基，PBS洗三遍，每孔加入考馬斯亮藍R250(2.5 mg/mL)1 mL染色2 h，棄染色液，PBS洗三遍，拍照。

2.4 細胞周期檢測

取對數(shù)生長期細胞胰酶消化后呈單細胞懸液，接種于6孔板，待細胞長到80%左右，加入不同濃度tagitinin D處理12 h，收集細胞制成單細胞懸液，70%乙醇4 ℃過夜，PBS洗一遍，加入500 μL PBS重懸細胞，加入20 μL RNase，放37 ℃孵育30 min，再加入50 μL PI，冰上放置30 min，流式細胞儀檢測細胞周期。

2.5 細胞凋亡檢測

取對數(shù)生長期細胞制呈單細胞懸液，接種于6孔板，待細胞長到80%左右，加入tagitinin D 20 μM處理不同時間(24、48、72 h)，收集細胞制成單細胞懸液，PBS洗一遍，按凋亡試劑盒說明書加入試劑，用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

2.6 檢測活性氧的變化

取對數(shù)生長期細胞制呈單細胞懸液，接種于6孔板，待細胞長到80%左右，加入不同濃度tagitinin D處理12 h，棄培養(yǎng)基，加入無血清培養(yǎng)基2 mL，再加入DCFH-DA(20 μM)，室溫孵育15 min，棄培養(yǎng)基，加入PBS洗三遍，拍照，再收集細胞用流式細胞儀檢測熒光強度。

2.7 Western blot檢測ER stress相關(guān)蛋白表達

取對數(shù)生長期細胞制呈單細胞懸液，接種于6孔板，待細胞長到80%左右，加入tagitinin D 6 μM處理不同時間(12、24、36 h)，收集細胞制作蛋白樣本。10%聚丙烯酰胺SDS凝膠電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉2 h，加入一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫2 h，PBST洗滌3次，加化學發(fā)光液放入全自動化學發(fā)光圖像分析系統(tǒng)中曝光。

2.8 統(tǒng)計學分析

實驗重復3次且每組至少3個復孔，用GraphPad Prism 7軟件進行統(tǒng)計分析處理，結(jié)果以均值±標準差表示，用t檢驗進行組間差異比較。P<0.05差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果與分析

3.1 Tagitinin D對人肝癌HepG2細胞活力的影響

用MTT法檢測tagitinin D對HepG2細胞活力的影響，加入不同濃度tagitinin D處理細胞72 h，用酶標儀檢測吸光度值，計算出tagitinin D作用于HepG2細胞的活力及IC50值= 7.79 ± 0.58 μM，如圖2所示，說明tagitinin D能抑制HepG2細胞活力。

3.2 Tagitinin D對HepG2細胞體外成瘤能力的抑制

圖2 Tagitinin D抑制HepG2細胞活力Fig.2 Tagitinin D inhibited cell viability of HepG2 cells

Tagitinin D不同濃度(1和2 μM)作用于HepG2細胞12天后，兩個處理組克隆球的數(shù)量和大小明顯低于對照組(圖3A)，說明tagitinin D能顯著抑制腫瘤細胞體外成瘤能力。

圖3 Tagitinin D對HepG2細胞體外成瘤能力的影響Fig.3 Tagitinin D inhibited the colony formation ability of HepG2 cells

3.3 Tagitinin D使人肝癌HepG2細胞周期阻滯在G2/M期

用流式細胞儀檢測tagitinin D對HepG2細胞周期的影響，如圖4A所示：tagitinin D處理組細胞的S期比例由26.1%下降到17.2%，G2/M期比例由28.9%升高至42.8%，說明tagitinin D處理可將大部分細胞阻滯在G2/M期。

圖4 Tagitinin D對HepG2細胞周期的影響Fig.4 Tagitinin D induced cell cycle arrest at the G2/M phase in HepG2 cells

3.4 Tagitinin D誘導人肝癌HepG2細胞凋亡

用流式細胞儀檢測tagitinin D誘導人肝癌HepG2細胞凋亡，如圖5A所示，當處理濃度為20 μM，處理時間為24、48、72 h細胞凋亡率(早期凋亡+晚期凋亡)分別為22%、59.7%、96.6%；說明tagitinin D促進細胞凋亡是時間依賴的。

圖5 Tagitinin D促進HepG2細胞凋亡Fig.5 Tagitinin D induced apoptosis of HepG2 cells in a time-dependent manner

3.5 Tagitinin D增加人肝癌HepG2細胞內(nèi)活性氧

3.5.1 Tagitinin D和NAC聯(lián)用使人肝癌HepG2細胞活力回復

為研究tagitinin D誘導人肝癌HepG2細胞凋亡的作用途徑，加入活性氧(reactive oxygen species，ROS)清除劑NAC和泛caspases抑制劑Z-VAD-FMK與tagitinin D聯(lián)合處理，如圖6所示：加入Z-VAD-FMK，細胞活力沒有回復；加入NAC后，細胞活力明顯回復。以上結(jié)果說明tagitinin D降低腫瘤細胞活力是依賴于ROS途徑的。

圖6 Tagitinin D和NAC聯(lián)用使人肝癌HepG2細胞活力回復Fig.6 The cell death induced by tagitinin D can be rescued by the ROS scavenger,NAC

3.5.2 DCFH-DA檢測人肝癌HepG2細胞內(nèi)活性氧變化

用探針DCFH-DA檢測細胞內(nèi)源活性氧的累積。如圖7所示，隨著tagitinin D處理濃度增加，熒光強度逐漸增強(圖7A)及平均熒光強度增加(圖7B)；加NAC后，熒光強度有所回復；說明tagitinin D能顯著引起細胞內(nèi)源性ROS的增加。

3.6 Tagitinin D對人肝癌HepG2細胞ER stress 相關(guān)蛋白的影響

ER stress作為ROS的下游，并且持續(xù)、強烈的ER stress能顯著促進細胞凋亡。既然tagitinin D促進細胞凋亡依賴于ROS，且不依賴于caspases途徑，因此檢測tagitinin D對ER stress的影響是必要的。如圖8所示，tagitinin D處理組濃度6 μM，隨著處理時間的變化，ER stress相關(guān)蛋白PDI、Ero1-Lα、Calnexin、Bip、IRE1α、p-eIF2α表達水平升高，表明tagitinin D是通過增加ROS引起ER stress并激活I(lǐng)RE1α和PERK信號通路進而誘導細胞凋亡。

圖7 Tagitinin D使HepG2細胞內(nèi)源活性氧增加Fig.7 Tagitinin D increased the endogenous ROS levels in HepG2 cells

圖8 Tagitinin D激活ER stressFig.8 Tagitinin D activated the ER stress signaling pathway in HepG2 cells

4 討論與結(jié)論

近年來，由于抗癌藥物的局限性，天然小分子化合物為新藥的研發(fā)起到促進作用，有報道抗癌藥物中一半來源于天然產(chǎn)物及其衍生物[14,15]，天然產(chǎn)物因具有廣泛的不同化學結(jié)構(gòu)從而其生物學活性也有區(qū)別，包括抗菌、免疫抑制、抗癌、抗炎等[16]。因此，發(fā)現(xiàn)更多天然產(chǎn)物的藥用價值以期為臨床研究提供依據(jù)是必不可少的。本文主要從周期阻滯、誘導細胞凋亡及ER stress信號通路的影響研究tagitinin D促進人肝癌HepG2細胞凋亡的作用機制。

本實驗中，我們首先用MTT法檢測tagitinin D對人肝癌HepG2細胞活力的影響，實驗結(jié)果顯示隨著藥物處理濃度的增加，HepG2細胞活力顯著降低；通過克隆形成實驗表明，與對照組相比，隨著藥物處理濃度的增加，處理組克隆球形成變小且數(shù)量減少；用流式細胞儀檢測細胞周期，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過tagitinin D處理后且隨著濃度的增加，G2/M期比例逐漸升高，以上結(jié)果說明tagitinin D能顯著抑制HepG2細胞的活力和成瘤能力，并且將大部分細胞阻滯在G2/M期。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑是細胞凋亡途徑之一[17]，越來越多的證據(jù)表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能與ROS產(chǎn)生有關(guān)，并誘導細胞凋亡[18,19]。ROS是指超氧化物、過氧化氫、過氧亞硝酸鹽和羥自由基，他們是不穩(wěn)定的分子種類，可以破壞細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，并激活細胞內(nèi)信號傳導級聯(lián)[20]。有研究表明，雷公藤甲素能增加細胞內(nèi)ROS誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激使細胞凋亡[21]。本研究通過凋亡和ROS檢測實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，tagitinin D誘導HepG2細胞凋亡且細胞內(nèi)ROS增加，說明tagitinin D通過依賴于ROS誘導細胞凋亡。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激由多種因素引起，如鈣離子失調(diào)、ROS積累等造成大量未折疊蛋白和錯誤折疊蛋白聚集，引發(fā)ER stress[22]。一旦產(chǎn)生這種應(yīng)激時間過長，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)失衡，就會激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡信號，引起細胞凋亡。為進一步探討tagitinin D是否通過細胞內(nèi)ROS積累激活ER stress信號通路或caspases途徑引起細胞凋亡。加入ROS清除劑NAC和泛caspases抑制劑Z-VAD-FMK后，明顯看到加NAC后細胞活力回復；用探針DCFH-DA檢測到細胞內(nèi)ROS的增加；Western blot結(jié)果可得：PDI、Ero1-Lα、Calnexin、Bip、IRE1α、p-eIF2α蛋白表達增加；說明tagitinin D通過細胞內(nèi)ROS增加，激活ER stress信號通路誘導細胞凋亡。

綜上所述，tagitinin D抑制人肝癌HepG2細胞活力和體外成瘤能力；通過阻滯細胞在G2/M期影響細胞增殖；同時使細胞內(nèi)ROS的增加激活ER stress信號通路誘導細胞凋亡。