姜曉琳，張繼秋，徐瑞蕊，蔣明浩，亢倩麗，楊 勇，鞏麗麗*

1山東中醫(yī)藥大學藥學院；2山東中醫(yī)藥大學實驗中心，濟南 250355

防風為傘形科植物防風(Saposhnikoviadivaricata(Trucz.) Schischk.)未抽花莖的干燥根。味辛、甘，微溫，歸膀胱、肝、脾經(jīng)，有祛風解表、勝濕止痛、止痙的功效[1,2]。防風的化學成分主要包括色原酮類、香豆素類、有機酸、多糖類等[3,4]。Yao等[5]通過研究白芷、防風、紫蘇葉單味藥材及配伍體外對呼吸道核胞病毒的影響，結(jié)果證明防風具有抗呼吸道核胞病毒的活性，且與紫蘇配伍后效果顯著，但是關(guān)于其單一味藥抗病毒活性的藥效成分及作用機制尚未見報道。因此本實驗欲采用CPE法證實防風單味藥的抗流感病毒活性及其抗流感病毒活性成分。近年來指紋圖譜技術(shù)用于中藥研究非常廣泛，能夠?qū)χ兴帍碗s的化學成分進行表征，但是無法體現(xiàn)與藥效的關(guān)聯(lián)性。中藥譜效關(guān)系學是將指紋圖譜與其藥效作用結(jié)合起來，不僅可以使指紋圖譜中化學成分體現(xiàn)出相應的藥效，而且還能闡明指紋圖譜特征與藥效的相互關(guān)系，確定相應的藥效物質(zhì)基礎，從而使構(gòu)建的藥效指紋圖譜更有針對性的控制中藥質(zhì)量[6]。高效液相色譜-串聯(lián)四級桿靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜(UPLC-Q-Exactive Orbitrap/MS)采用高效液相色譜對復雜混合物進行快速分離，結(jié)合高性能四級桿的母離子選擇性與高分辨的準確質(zhì)量數(shù)Orbitrap檢測技術(shù)實現(xiàn)對復雜樣品的定性和定量分析，具有靈敏度高、準確度高、檢測效率高等特點[7]。本實驗建立防風不同極性部位LC-MS指紋圖譜，比較不同極性部位的抗流感病毒活性，采用Spearman分析、灰色關(guān)聯(lián)度分析及最小偏二乘回歸分析三種方法分析防風不同極性部位與抗流感病毒活性的譜效關(guān)系，根據(jù)秩相關(guān)系數(shù)、關(guān)聯(lián)度及VIP值共同推斷出主要藥效成分，為防風抗流感病毒藥效的物質(zhì)基礎研究提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

EYELAN-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本東京理化器械株式會社)；XMTD-204恒溫水浴鍋(天津賽得利斯實驗分析儀器制造廠)；1/10萬電子分析天平(上海精密科學儀器有限公司)；Centrifuge 5418離心機(Eppendorf公司)；KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；UltiMate 3000超高效液相色譜儀(美國Thermo公司)；UPLC-Q-Exactive Orbitrap/MS(美國Thermo公司)；SD-CJ-ID生物安全柜(蘇州凈化設備廠)；HF90 CO2恒溫培養(yǎng)箱(上海力申科學儀器有限公司)；CKX-31倒置顯微鏡(olympus公司)；TC20細胞計數(shù)儀(Bio-Rad公司)；移液槍(Eppendorf公司)。

1.2 材料

防風(批號2019.03.22)，經(jīng)由山東中醫(yī)藥大學中藥鑒定教研室徐凌川教授鑒定為傘形科防風屬植物防風(Saposhnikoviadivaricata(Trucz.) Schischk.)的干燥根。環(huán)己烷(分析純，天津市富宇精細化工有限公司)；二氯甲烷(分析純，天津市富宇精細化工有限公司)；乙酸乙酯(分析純，天津市富宇精細化工有限公司)；正丁醇(分析純，天津市富宇精細化工有限公司)；甲醇(G，R，天津市四友精細化學品有限公司)；利巴韋林注射液(Rebavinrin injection，山東魯抗辰欣藥業(yè)股份有限公司，批號1612246411，濃度50 mg/mL)；酪氨酸(批號140609-200610，純度：99.57%)、咖啡酸(批號110885-201703，純度99.65%)、7-羥基香豆素(批號111739-200501，純度99.48%)，均購于上海恒遠生物科技有限公司；娃哈哈純凈水、蒸餾水；DMSO溶液(1427C108)；DMEM培養(yǎng)基(Gibio公司)；PBS緩沖溶液(Gibio公司)；胰酶(Gibio公司)；新生牛血清(ABW)；青霉素和鏈霉素(Hyclone)；MDCK細胞(由山東省醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所微生物室提供，本科室保存)；H1N1病毒(2000年10月引自中國預防醫(yī)學科學院病毒所毒種室)。

2 實驗方法

2.1 防風不同極性部位的制備

稱取200 g防風藥材，粉碎，過2和4號篩，得粗粉。加十倍量甲醇，超聲提取30 min，重復兩次，合并濾液，抽濾，得到濾液。減壓回收溶劑，得到浸膏。加入適量的蒸餾水，制成混懸液，然后依次用等量的環(huán)己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、水各萃取兩次，得到各部位的萃取液。減壓回收各部位溶劑，得到各極性部位浸膏和粉末。

2.2 防風不同極性部位的抗病毒活性

2.2.1 防風不同極性部位供試品溶液的制備

稱取防風各極性部位浸膏適量，用DMEM培養(yǎng)基溶解，配成50 mg/mL的溶液。

2.2.2 病毒毒力的測定

將處于對數(shù)生長期的MDCK細胞用0.25%的胰酶消化，調(diào)整細胞濃度至1×104個/mL，每孔100 μL接種至96孔板，恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)長至單層，棄掉培養(yǎng)液。依次加入10倍系列稀釋的H1N1病毒液100 μL，每個濃度重復四孔，同時設置細胞對照。在37 ℃，5% CO2條件下恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，各孔分別加入5 mg/mL的MTT溶液10 μL，培養(yǎng)4 h，吸棄染液，加入DMSO溶液100 μL，室溫下脫色10 min，震蕩6 min，酶標儀測490 nm下的OD值，根據(jù)Reed-Muench公式計算病毒的半數(shù)感染濃度TCID50。

細胞存活率=各組OD值/正常細胞OD值×

100%

細胞比距=(高于50%病變率-50%)/

(高于50%病變率-低于50%病率)×100%

TCID50= Antilg(Ig高于50%CPE百分率病毒稀釋度+比距×稀釋因子對數(shù))

2.2.3 藥物對細胞的毒性作用

按照2.2.1中方法將防風各極性部位藥物用DMEM培養(yǎng)基按2倍比稀釋10個濃度梯度，依次接種于MDCK細胞已經(jīng)長成單層的96孔板中，每個濃度重復3孔，同時設置正常細胞對照組，37 ℃，5% CO2條件下恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，倒置顯微鏡下觀察細胞病變程度，用MTT染色，用酶標儀在490 nm下測定OD值，根據(jù)Reed-Muench公式計算細胞半數(shù)中毒濃度TC50，找到最大無毒濃度TC0。

2.2.4 藥物體外抗病毒實驗方法

將1×104個/mL處于對數(shù)生長期的MDCK細胞接種于96孔板上，每孔100 μL，待細胞長成單層后，吸棄培養(yǎng)液，將藥物從最大無毒濃度開始，按二倍比系列稀釋共12個濃度，設細胞對照、病毒對照、利巴韋林為陽性對照(10 mg/mL),每個濃度重復3孔，除細胞對照外，各孔加入50 μL含100個TCID50的病毒液，混合均勻。37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察病毒對照組病變情況，待細胞出現(xiàn)90%及以上病變時采用CPE法記錄各組藥物抑毒情況，用MTT法測量OD值，根據(jù)Reed-Muench公式計算防風各極性部位的半數(shù)有效濃度(EC50)及治療指數(shù)(TI)，C為供試品初始濃度。

EC50= [Antilog(高于50%CPE百分率病毒稀釋度的值-比距)]×C

治療指數(shù)(TI)= 半數(shù)毒性濃度(TC50)/半數(shù)有效濃度(EC50)

2.3 防風不同極性部位LC-MS指紋圖譜的建立

2.3.1 防風不同極性部位供試品溶液的制備

稱取防風甲醇總提物及相當于生藥量1 g的環(huán)己烷部位、二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和萃取后水部位浸膏，用70%甲醇溶解，配成濃度分別為11.52、3.75、0.63、5.97、150.75 mg/mL的供試品溶液。

2.3.2 LC-MS液質(zhì)條件

Halo-C18柱(100 mm×2.1 mm，2.7 μm)，流動相0.05%甲酸水溶液(A)-0.05%甲酸乙腈溶液(B)，梯度洗脫(0～4 min，5% B；4～8 min，5%→15% B；8～23 min，15%→75% B；23～28 min，75%→100% B；28～30 min，100% B)，柱溫30℃，進樣量3 μL，體積流量0.3 mL/min。源內(nèi)溫度320 ℃，輔助氣溫度350 ℃，S-lenS RF水平55%，分辨率70 000，質(zhì)譜掃描范圍m/z80～1 200。

2.3.3 精密度試驗

取防風甲醇總提物樣品制備供試品溶液1份，連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖，以7號峰為參照物峰，計算各主要色譜峰的相對保留時間和相對峰面積，其RSD值均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 重復性試驗

取防風甲醇總提物樣品制備供試品溶液6份，分別進樣，記錄色譜圖，以7號峰為參照物峰，計算各主要色譜峰的相對保留時間和相對峰面積，其RSD值均小于3%，表明實驗重復性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗

取防風甲醇總提物樣品制備供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h進樣，記錄色譜圖，以7號峰為參照物峰，計算各主要色譜峰的相對保留時間和相對峰面積，其RSD值均小于3%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 數(shù)據(jù)分析

本實驗數(shù)據(jù)的Spearman分析、灰色關(guān)聯(lián)度分析及偏最小二乘回歸分析采用Excel 2016、Simca-p 19.0軟件處理。

3 結(jié)果與分析

3.1 抗流感病毒實驗結(jié)果

根據(jù)文獻[8]，一般認為TI值≥2.00，證明藥物有抗病毒活性，TI值≥4.00，其抗病毒成分有研究價值。本實驗研究結(jié)果表明，防風不同極性部位藥物對H1N1流感病毒均有不同程度的抑制作用，其中水部位藥物抗H1N1流感病毒活性最高，其TI值為54.32，甲醇總提物部位藥物抗H1N1流感病毒活性次之，其TI值為48.76，其他部位的抗H1N1流感病毒活性相對較弱，見表1

3.2 數(shù)理統(tǒng)計與顯著性檢驗

本文表格中TC50、EC50由CPE觀察得到。采用SPSS 19.0軟件分析上述數(shù)據(jù)。選擇單因素方差分析，組間比較采用t檢驗，以P= 0.05為顯著性水準，分析結(jié)果見圖1。與陽性對照藥利巴韋林(EC50為7.843 6 μg/mL，TI為36.25)比較，甲醇總提物與萃取水部位差異顯著(P< 0.05)，抗流感病毒活性較強。

3.3 樣品中成分的鑒定

取“2.3.1”的供試品溶液，按照“2.3.2”的色譜條件進行分析，得到防風不同極性部位指紋圖譜，見圖2。使用Xcalibur 3.0軟件(Thermo公司，美國)對高分辨質(zhì)譜信息進行數(shù)據(jù)分析，并結(jié)合相關(guān)文獻及對照品的比對進行峰的指認，最終確定了28個色譜峰所對應的化合物，結(jié)果見表2。

表1 防風不同極性部位抗H1N1病毒活性的檢測結(jié)果

圖1 防風不同極性部位抗流感病毒TI值比較(t檢驗)Fig.1 Comparison of TI anti-influenza virus values in different polar parts of S.divaricata (t test)注：與S7比較：*P < 0.05。Note:Compared with S7,*P < 0.05.

3.4 防風不同極性部位抗流感病毒活性的譜效相關(guān)性分析

3.4.1 防風不同極性部位總離子流圖分析

參考文獻及對照品，對照甲醇總提物色譜峰，環(huán)己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、水部位分別鑒定出16、21、15、15、13個化合物，如表3。

3.4.2 Spearman分析

Spearman分析不僅能發(fā)現(xiàn)線性關(guān)系，也能發(fā)現(xiàn)單調(diào)的非線性關(guān)系；對分析的變量數(shù)據(jù)不需要正態(tài)性假設，還可以適用于等級數(shù)據(jù)(無法定量的順序數(shù)據(jù))；對異常數(shù)值敏感度低，因此，Spearman相關(guān)方法適用性更廣[17]。

圖2 防風不同極性部位在正離子模式下的UPLC-Q-Exactive Orbitrap/MS提取總離子流圖Fig.2 The extract ion chromatogram of in positive ion mode from S.divaricata different polar parts using UPLC-Q-Exactive Orbitrap/MS注：A：甲醇提取總部位；B：環(huán)己烷部位；C：二氯甲烷部位；D：乙酸乙酯部位；E：正丁醇部位；F：萃取后水部位。Note:A:Total part of methanol extraction;B:Cyclohexane part;C:Dichloromethane part;D.Ethyl acetate part;E:n-Butanol part;F:Water part after extraction.

表2 防風不同極性部位的LC-MS數(shù)據(jù)

續(xù)表2(Continued Tab.2)

No.tR(min)分子式Formula準分子離子[M+H]+(m/z)測量值Calculated value質(zhì)譜數(shù)據(jù)Mass data(m/z)化學成分Compound2420.50C12H8O5233.044 4233.043 7174.045 5、218.021 7、235.063 45-羥基-8-甲氧基補骨脂素[9]2520.51C19H20O5329.138 4329.138 283.049 7、229.084 8、247.095 3紫花前胡素[9]2620.54C17H16O5301.107 1301.107 169.071 0、218.021 2、233.044 6珊瑚菜素[9]2721.44C19H22O6347.148 9347.147 8217.048 0、259.094 03'-O-2-丁酰亥茅酚[10-13]2822.38C20H22O6359.148 9359.148 7200.236 5、279.158 73'-O-當歸酰亥茅酚[10-13]

注：*根據(jù)對照品確定的物質(zhì)。

Note：*Substance identified by reference.

表3 防風不同極性部位化合物峰強度

注：相應保留時間下未檢測到的峰強度為“1”。

Note：The peak intensity not detected at the corresponding retention time is "1".

本實驗將防風不同極性部位化合物峰強度與抗流感病毒活性進行相關(guān)性分析(P<0.05)，參考文獻[18]，計算Spearman秩相關(guān)系數(shù)(rs)，如表4，|rs|≥0.8表示高度相關(guān)，0.5≤|rs|<0.8表示中度相關(guān)，0.3≤|rs|<0.5表示低度相關(guān)，|rs|<0.3表示不相關(guān)，rs為正表示正相關(guān)。本實驗按照以上參數(shù)為標準，確定1、5、6、7、10、11、12、13、20、24號峰與藥效作用相關(guān)。

表4 Spearman秩相關(guān)系數(shù)(rs)

3.4.3 灰色關(guān)聯(lián)度分析[19]

本實驗研究防風不同極性部位化合物峰強度對流感病毒的抑制作用，將治療指數(shù)(TI)作為母序列，記為X0(k)；不同極性部位化合物峰強度作為子序列，記為X1(k)，X2(k)，…，X28(k)，n=1,2,…,6。采用歸一化法對數(shù)據(jù)進行無量綱化處理，Xi(k)=Xi(k)/Xi[SUM(1～k)]，i=0,1,2,…,28。

(1)關(guān)聯(lián)度系數(shù)計算

ξi(k)=(△min+ρ*△max)/(△i(k)+ρ*max)；△i(k)=∣Xi(k)-X0(k)∣

△min=min∣X0(1)～Xi(k)∣，△max=max∣X0(1)～Xi(k)∣

ρ為分辨系數(shù)，0 ≤ρ≤ 1，通常取ρ=0.5

將防風不同極性部位化合物峰強度與抗流感病毒活性進行灰色關(guān)聯(lián)度分析，參考文獻[19]，以γ≥0.75表示子序列對母序列有影響，計算關(guān)聯(lián)度γ，如表5。確定1、3、5、7、8、9、11、12、13、20、22、23、24、25、26、28號峰對抗流感病毒活性有影響。

表5 灰色關(guān)聯(lián)度(γ)

3.4.4 偏最小二乘回歸(PLSR)法分析

偏最小二乘回歸(PLSR)分析法是從應用領(lǐng)域中提出的一種新型多元數(shù)據(jù)分析方法。近十幾年來，它在理論和應用方面都已得到迅速的發(fā)展。偏最小二乘回歸分析主要適用于多因變量對多自變量的線性回歸建模，并可以有效地解決許多用普通多元性回歸無法解決的問題[20]。本實驗以防風不同極性部位化合物峰強度為自變量，抗流感病毒活性為因變量，進行譜效相關(guān)性分析。

本實驗利用SIMCA-P 19.0軟件，采用PLSR分析法進行譜效相關(guān)性分析，計算得到28個特征峰與抗流感病毒活性的標準化回歸系數(shù)(圖2-A)和VIP值(圖2-B)。VIP>1時，自變量在解釋因變量時具有重要意義[21]。由圖3可知，峰1、3、5、7、8、9、11、13、20、22、24、28的VIP值均大于1，且其回歸系數(shù)均為正相關(guān)，故說明這12個峰對應的物質(zhì)對于細胞抗流感病毒作用有重要影響。

4 討論

本實驗以防風為研究對象，采用CPE法對防風總提取物及不同極性部位進行了體外抗流感病毒活性研究。根據(jù)測定的TI值,抗流感病毒活性順序為：水部位>甲醇總提物>正丁醇部位>環(huán)己烷部位>二氯甲烷部位>乙酸乙酯部位。為探究防風中具體的抗流感病毒活性成分，本實驗將防風抗流感病毒TI值與不同極性部位的共有峰峰強度進行譜效相關(guān)分析。采用Spearman簡單相關(guān)對實驗進行初步分析，而后運用灰色關(guān)聯(lián)度分析，但灰色關(guān)聯(lián)度分析對數(shù)據(jù)的要求較低，無法建立相應的數(shù)學模型。偏最小二乘回歸分析法集多元線性回歸、典型相關(guān)分析和主成分分析的基本功能于一體，可操作性高，建立的數(shù)學模型較為準確，確保模型較好的精度所需包含的成分數(shù)量，保證了模型的推廣性[22]。綜合上述分析方法的利弊，本實驗聯(lián)用Spearman分析、灰色關(guān)聯(lián)度分析、偏最小二乘回歸分析三種方法，可以更全面地分析防風不同極性部位與抗流感病毒活性的譜效關(guān)系，以保證分析結(jié)果的準確性。

本實驗建立了防風不同極性部位的LC-MS指紋圖譜，確定了28種化合物，將28種化合物對應的峰強度與抗流感病毒活性指標進行相關(guān)計算。由Spearman分析、灰色關(guān)聯(lián)度分析、偏最小二乘回歸分析方法共同得出1、5、7、11、13、20、24號峰對抗流感病毒活性有影響，即焦谷氨酸、divaricatacid、升麻苷、亥茅酚苷、補骨脂素、異嗪皮啶、5-羥基-8-甲氧基補骨脂素。其中升麻苷、補骨脂素及5-羥基-8-甲氧基補骨脂素與文獻報道中發(fā)現(xiàn)的升麻苷、補骨脂素類化合物[23,24]具有一定的抗流感病毒能力相一致，進一步論證了本實驗的可靠性，由此可推測，秩相關(guān)系數(shù)、關(guān)聯(lián)度、VIP值均高于升麻苷、補骨脂素的焦谷氨酸、divaricatacid、亥茅酚苷、異嗪皮啶同樣具有抗流感病毒活性，后期可利用細胞病變效應(CPE)法對焦谷氨酸、divaricatacid、亥茅酚苷、異嗪皮啶四個單體成分的抗流感病毒活性進行測定，進一步確證其抗流感病毒活性。本實驗為探究防風的抗流感病毒作用機制提供參考依據(jù)，為下一步深入研究防風抗流感病毒活性物質(zhì)基礎及化學結(jié)構(gòu)提供初步方向。

圖3 防風PLSR標準化回歸系數(shù)圖(A)和對藥效的VIP貢獻圖(B)Fig.3 PLSR normalized regression coefficient graph (A) and contribution of characteristic peaks of S.divaricata to VIP (B)