林思文，諶少波，殷嫦嫦，邵銀初*

1中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇八醫(yī)院，南昌330001；2九江學(xué)院，九江 332000

骨質(zhì)疏松癥常見于絕經(jīng)后婦女，目前學(xué)術(shù)上普遍觀點(diǎn)認(rèn)為：絕經(jīng)后婦女雌激素水平逐漸下降，成骨細(xì)胞增生減弱，破骨細(xì)胞過度活躍，造成全身性骨量減少、骨組織顯微結(jié)構(gòu)破壞，從而顯著增加了骨折的風(fēng)險(xiǎn)，影響生存質(zhì)量。因此，研究如何延緩絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松癥的發(fā)展進(jìn)程，漸漸成為了老年醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)熱門話題。淫羊藿(Epimedii Folium)作為一味祖國(guó)傳統(tǒng)中藥，自古以來為補(bǔ)腎陽、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕之要藥。其中，淫羊藿總黃酮(total flavonoids of Epimedii Folium，EF)為從淫羊藿植株中提取的黃酮類化合物，我們的前期研究發(fā)現(xiàn)EF具有促進(jìn)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)成骨分化的作用[1]。此次試驗(yàn)旨在研究EF促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化是否與雌激素受體(estrogen receptor，ER)有關(guān)，從而確定其是否具有類雌激素作用，對(duì)于探討激素替代療法治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥有積極意義。

1 材料與試劑

1.1 細(xì)胞

購(gòu)自江陰齊氏生物科技有限公司第1代hBMSCs。

1.2 主要試劑及耗材

EF(九江學(xué)院藥學(xué)院提供，純度>95%，用DMSO配置成40 mg/mL的儲(chǔ)存液于4 ℃?zhèn)溆?；ICI182780(Selleck公司)；DMSO、瓊脂糖、TAE、PBS粉、青鏈霉素(北京索萊寶科技有限公司)；胎牛血清(FBS)、0.25%胰蛋白酶-EDTA(美國(guó)Gibco公司)；α-MEM培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone公司)；茜素紅粉(西隴化工股份有限公司)；GREENspin組織/細(xì)胞RNA提取試劑盒(北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司)；Hi Fi-MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)；2×Taq Master Mix、DNA Marker：(北京近岸科技有限公司)；基因引物(南京金斯瑞生物科技有限公司)。

1.3 主要儀器

超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；三氣細(xì)胞培養(yǎng)箱(德國(guó)Eppendorf公司)；TS100-F 倒置相差顯微鏡(日本Nikon公司)；FACS Calibur流式細(xì)胞儀(BD公司)；酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek公司)；凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)SIM公司)；冷凍高速離心機(jī)(珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司)；Mini水平電泳槽(美國(guó)BIO-RAD公司)；PCR儀(杭州博日科技有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 hBMSCs的培養(yǎng)、傳代及細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

將購(gòu)自江陰齊氏生物科技有限公司的含第1代hBMSCs的培養(yǎng)瓶吸棄多余培養(yǎng)基后，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，待貼壁細(xì)胞融合達(dá)80～90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞后加入適量完全培養(yǎng)基(含1%雙抗及10%FBS的α-MEM培養(yǎng)基)充分吹打混勻，以1∶2分裝于兩個(gè)培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以此方法繼續(xù)傳代，細(xì)胞逐漸純化。待細(xì)胞量滿意后可用含10%FBS的DMSO凍存液凍存部分細(xì)胞備用。用倒置相差顯微鏡觀察各代細(xì)胞不同時(shí)間的細(xì)胞形態(tài)。

2.2 流式細(xì)胞儀鑒定hBMSCs

取第4代hBMSCs進(jìn)行細(xì)胞鑒定。待第4代hBMSCs貼壁融合達(dá)80%～90%時(shí)，以不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，離心(1000 rpm，5 min)后棄上清，用含10%FBS的PBS離心洗滌細(xì)胞兩遍，再用含10%FBS的PBS重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1×106/mL，以每管80 μL分裝至4個(gè)1.5 mL EP管中，分別加入FITC標(biāo)記的抗人CD90和CD45單抗，并設(shè)置同型對(duì)照組(含F(xiàn)ITC標(biāo)記的抗HLA-DR單抗)、空白對(duì)照組，室溫避光30 min后以含10%FBS的PBS離心洗滌細(xì)胞兩遍，最后每管加入500 μL PBS充分重懸，2 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2.3 CCK-8法檢測(cè)EF對(duì)hBMSCs增殖的影響

取第4～6代hBMSCs，待細(xì)胞貼壁融合達(dá)80%～90%后，以0.25%胰蛋白酶-EDTA消化細(xì)胞，PBS離心洗滌兩次后，加入培養(yǎng)基(含10%FBS的α-MEM)將細(xì)胞充分重懸并計(jì)數(shù)。調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1×104/mL，以每孔200 μL接種于96孔板中，置入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h，棄去培養(yǎng)基，分別加入含不同濃度(0、2.5、5、10、20、40 μg/mL)EF(以事先配置好的儲(chǔ)存液加入空白培養(yǎng)基配置含40 μg/mL EF的含0.1%DMSO培養(yǎng)基，再與含0.1%DMSO不含藥物培養(yǎng)基不同比例混合配置成目標(biāo)濃度)、均含0.1%DMSO的培養(yǎng)基，每孔200 μL。每個(gè)濃度設(shè)置4個(gè)復(fù)孔及1個(gè)不含細(xì)胞的對(duì)照孔。分別在第12、24、48、72 h每孔加入10μL的CCK-8溶液，37 ℃孵育2 h后上酶標(biāo)儀在450 nm光波長(zhǎng)檢測(cè)各孔吸光度A。計(jì)算各濃度吸光度OD=A藥物-A對(duì)照，并繪制成圖表。

2.4 EF促進(jìn)hBMSCs成骨分化的細(xì)胞形態(tài)觀察

取第4～6代hBMSCs消化后按105/mL接種于細(xì)胞數(shù)六孔板中，24 h后，更換加有10 μg/mL EF的含10%FBS的α-MEM培養(yǎng)基(含0.1%DMSO)，并設(shè)置空白對(duì)照組(含10%FBS的α-MEM培養(yǎng)基，含0.1%DMSO)，每3天換液一次，誘導(dǎo)14天，定期利用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

2.5 茜素紅染色

取第4～6代hBMSCs消化后按105/mL接種于細(xì)胞數(shù)六孔板中，24 h后，按以下分組更換培養(yǎng)基：對(duì)照組(含10%FBS的α-MEM培養(yǎng)基)、EF組(添加20 μg/mL EF的含10%FBSα-MEM培養(yǎng)基)、EF+ICI182780組(添加10 μg/mL EF及1 μmol/L ICI182780的含10%FBSα-MEM培養(yǎng)基)，每3天換液一次，誘導(dǎo)14天。棄去培養(yǎng)基，PBS清洗2次，95%乙醇固定10min，三蒸水洗2遍，0.1%茜素紅(pH8.3)于37 ℃下反應(yīng)30 min，PBS沖洗兩遍后置于倒置相差顯微鏡下觀察。

2.6 RT-PCR檢測(cè)OPN、ALP基因的表達(dá)

按以上分組作用于細(xì)胞，誘導(dǎo)14天后消化并收集細(xì)胞，按RNA提取試劑盒說明提取細(xì)胞RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明合成cDNA，加入上下游引物(序列見表1)及Taq擴(kuò)增，將產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳后在凝膠成像系統(tǒng)紫外燈下拍照。并用Image J軟件分析條帶灰度。

表1 基因引物序列

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 hBMSCs培養(yǎng)、傳代及細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

傳代細(xì)胞中，單個(gè)細(xì)胞呈梭形、多角形貼壁生長(zhǎng)，有形態(tài)不同的突起，相互之間無規(guī)律生長(zhǎng)(見圖1-1)；隨著細(xì)胞數(shù)量的增多，細(xì)胞逐漸匯合，突起逐漸消失，細(xì)胞排列逐漸規(guī)律，呈成纖維細(xì)胞樣(見圖1-2、圖1-3)；8～9天后，細(xì)胞逐漸鋪滿瓶底，細(xì)胞之間連接緊密，呈旋渦狀、魚群樣貼壁生長(zhǎng)(見圖1～4)。

3.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面抗原

經(jīng)傳代后的hBMSCs經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志CD90表達(dá)呈陽性(陽性率92.36%)，而造血干細(xì)胞標(biāo)志CD45表達(dá)呈陰性(95.40%)，結(jié)果表明細(xì)胞均一性良好(圖2)。

3.3 EF對(duì)hBMSCs增殖的影響

不同濃度EF作用于hBMSCs后，對(duì)hBMSCs的增殖作用存在不同：高濃度組(10、20、40 μg/mL組)對(duì)細(xì)胞增殖均有不同程度的抑制作用，并且濃度越高、抑制作用越明顯；而低濃度組(2.5和5 μg/mL組)反而對(duì)細(xì)胞增殖存在一定程度的促進(jìn)作用(圖3)。我們選用對(duì)細(xì)胞有輕微抑制作用的10 μg/mL進(jìn)行細(xì)胞誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)。

圖1 P3代hBMSCs細(xì)胞形態(tài)觀察(10×10)Fig.1 Morphological observation of P3 generation hBMSCs (10×10)注：1.培養(yǎng)第3天；2.培養(yǎng)第5天；3.培養(yǎng)第7天；4.培養(yǎng)第9天。Note:1.3 days of culture;2.5 days of culture;3.7 days of culture;4.9 days of culture.

圖2 細(xì)胞表面CD90、CD45表達(dá)情況Fig.2 Expression of CD90,CD45 on cell surface

圖3 不同濃度EF作用hBMSCs不同時(shí)間的細(xì)胞吸光度值ODFig.3 Cell absorbance OD of hBMSCs exposed to different concentrations of EF at different time

3.4 EF促進(jìn)hBMSCs成骨分化的細(xì)胞形態(tài)觀察

EF作用于hBMSCs 后，3～7天內(nèi)，細(xì)胞形態(tài)逐漸由長(zhǎng)梭形向立方形或多邊形轉(zhuǎn)變；7天后隨著細(xì)胞的增殖，細(xì)胞開始重疊，相互聚集成團(tuán)并逐漸開始形成散在的細(xì)胞結(jié)節(jié)，細(xì)胞周圍形成沉積的鈣鹽，成團(tuán)狀或條索狀；14天后，細(xì)胞聚集成典型的骨小節(jié)結(jié)構(gòu)，為大小不等的不規(guī)則形，正常的原有細(xì)胞形態(tài)消失(圖4)。

圖4 EF作用hBMSCs的細(xì)胞形態(tài)觀察Fig.4 Morphological observation of hBMSCs induced by EF注：1.誘導(dǎo)第3天(10×10)；2.誘導(dǎo)第7天(10×10)；3.誘導(dǎo)第14天(10×10)；4.誘導(dǎo)第14天(10×40)。Note:1.3rd day (10 × 10);2.7th day (10 × 10) ;3.14th day (10 × 10);4.14th day (10 × 40).

3.5 鈣結(jié)節(jié)的茜素紅染色表現(xiàn)

茜素紅能將鈣結(jié)節(jié)染成紅色。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：與對(duì)照組相比，EF能促進(jìn)細(xì)胞形成大量的鈣結(jié)節(jié)(圖5-1和5-2)，而當(dāng)在有雌激素受體阻滯劑ICI182780存在的情況下，EF的這種促進(jìn)細(xì)胞形成鈣結(jié)節(jié)的能力明顯受抑制(圖5-3)。

圖5 茜素紅染色后鏡下觀(10×10)Fig.5 Alizarin red staining under microscope (10 × 10)注：1.對(duì)照組；2.EF組；3.EF+ICI182780組。Note:1.Control group;2.EF group;3.EF+ICI182780 group.

3.6 成骨相關(guān)基因OPN、ALP的表達(dá)

通過檢測(cè)OPN、ALP基因的表達(dá)情況表明：與對(duì)照組相比，EF能明顯上調(diào)OPN、ALP基因的表達(dá)(P<0.05)，而在EF加入ICI182780 以后，OPN、ALP基因的表達(dá)均明顯下降(P<0.05)(圖6)。

圖6 OPN、ALP mRNA的表達(dá)結(jié)果Fig.6 The expression of OPN,ALP mRNA注：1.對(duì)照組；2.EF組；3.EF+ICI182780組。與對(duì)照組比較，*P<0.05；與EF組比較，#P<0.05。Note:1.Control group;2.EF group;3.EF+ICI182780 group.Compared with control group,*P < 0.05;Compared with EF group,#P < 0.05.

4 討論

黃酮類化合物的類雌激素作用已在很多實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)[2-5]。利用黃酮類化合物的這一特征，學(xué)者們逐漸將其與治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥聯(lián)系起來[6，7]，我們選用EF對(duì)hBMSCs進(jìn)行誘導(dǎo)，來闡述這一發(fā)現(xiàn)。

實(shí)驗(yàn)首先使用不同濃度EF作用于細(xì)胞，探尋最合適的EF誘導(dǎo)濃度。本研究發(fā)現(xiàn)，較高濃度的EF作用于BMSCs主要表現(xiàn)為細(xì)胞毒作用，這可能與濃度高的EF增加細(xì)胞外滲透壓使細(xì)胞脫水死亡有關(guān)，而低濃度的EF細(xì)胞毒作用不明顯，甚至有促進(jìn)其增殖的作用。針對(duì)增殖和分化在一定程度上互相抑制的特點(diǎn)，我們選用輕度抑制hBMSCs增殖的EF濃度(即10 μg/mL)進(jìn)行誘導(dǎo)成骨分化實(shí)驗(yàn)。為了驗(yàn)證EF的類雌激素作用，實(shí)驗(yàn)設(shè)置了EF+ICI182780組，ICI182780作為ER的特異性抑制劑，可以抑制ER受體被激活產(chǎn)生的一系列生物學(xué)效用，本實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞形態(tài)、鈣結(jié)節(jié)染色、基因表達(dá)等多方面進(jìn)行了結(jié)果的闡述。較高濃度的鈣、磷、鎂沉積并附著于成骨細(xì)胞胞漿內(nèi)的線粒體嵴表面，茜素紅可與其中的鈣離子螯合，產(chǎn)生深紅色或紫紅色復(fù)合物，根據(jù)著色情況可以判斷鈣鹽沉積(鈣結(jié)節(jié))的狀況，從而一定程度上知道各實(shí)驗(yàn)組成骨分化的效率。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，EF能有效地促進(jìn)hBMSCs向成骨樣細(xì)胞分化并使產(chǎn)生明顯礦化鈣結(jié)節(jié)，在添加ICI182780后，這種現(xiàn)象明顯受抑制。OPN(骨橋蛋白，osteopontin)與ALP(堿性磷酸酶，alkaline phosphatase)均在骨組織中呈現(xiàn)高表達(dá)[8，9]，成骨細(xì)胞漿內(nèi)富含大量的OPN和ALP，血液中OPN和ALP的濃度可以反映成骨細(xì)胞活性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，EF能上調(diào)OPN、ALP基因的表達(dá)，而ICI182780卻能抑制EF的這種上調(diào)作用。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步表明：EF具有通過上調(diào)ER的表達(dá)從而促進(jìn)hBMSCs向成骨分化的作用。這為EF誘導(dǎo)hBMSCs成骨分化的類雌激素所用提供了一個(gè)良好的依據(jù)。

當(dāng)然，基于本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，有后續(xù)更為廣闊的空間供我們思考。為更好地驗(yàn)證EF的類雌激素作用，實(shí)驗(yàn)可以增加雌激素組作為對(duì)照，也可以將ER細(xì)分到ERα和ERβ兩個(gè)亞型上進(jìn)行進(jìn)一步的研究；甚至后期可以嘗試尋找一條相關(guān)的下游信號(hào)通路，研究具體的分子機(jī)制。